基于LC-MS代谢组学的红杆与绿杆型多花黄精化学成分比较研究

姜 武，翁国杭，陈家栋，叶传盛，姜鑫凯，陶正明

（1浙江省亚热带作物研究所，浙江温州 325005；2浙江乌岩岭国家级自然保护区管理中心，浙江温州 325500；3丽水亿康生物科技有限公司，浙江丽水 323800；4温州医科大学，浙江温州 325035）

0 引言

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)为百合科黄精属多年生草本植物，其干燥根茎为《中国药典》2020年版收载品种之一，具有补气养阴，健脾，润肺，降脂和益肾的功效[1-2]。现代药理研究表明，多花黄精含有多糖、皂苷类和黄酮类等主要有效成分，具有调节免疫，抗氧化、延缓衰老、抗疲劳、降血糖、调血脂、抗肿瘤、改善造血功能等多种药理作用[3]。研究表明，不同产地多花黄精中多糖、黄酮和浸出物含量存在差异，地理环境、生长年限和采收季节是影响其化学成分含量的关键因素[4]。倪天宇等[5]采集了浙江地区不同生境下的多花黄精，分别测定多花黄精的折干率、浸出物、黄精多糖、总黄酮、总皂苷和总酚含量，结果发现不同生境下多花黄精折干率、浸出物、多糖及总皂苷含有量差异显著；折干率与化学成分含有量均呈正相关。涂明峰等[6]对8个产地收集的多花黄精中多糖、黄酮、多酚、浸出物、Cu、Se、Pb、Cd的含量进行比较分析也发现不同产地的多花黄精化学成分含量存在一定的差异。多花黄精广泛分布于长江流域及珠江流域，其中安徽、湖南、浙江等地产多花黄精品质较好可视为道地产区。不同产地因其生长环境不同，化学成分也存在一定的差异性，气候、纬度、地理位置等多种因素都会对多花黄精的化学成分含量造成影响[7]。前人关于不同产地多花黄精化学成分差异性的研究较多[8-12]，但采用LC-MS代谢组学技术对不同产地多花黄精化学成分进行比较分析尚未见文献报道。中药材的化学成分是其药效的物质基础，因此，揭示不同种质多花黄精的化学成分差异是其质量评价的基础。植物代谢组学可对植物提取物中代谢组进行无差别代谢成分全分析，对具体药用部位及具体化学成分尚不清楚的中药材尤其适用，该技术已成功应用于半枫荷根[13]、野菊花[14]、林下山参生长年限鉴定[15]等研究。该技术不仅可以反映不同样品之间的相似性，还可确定不同样本的差异性，为中药质量控制提供了一种有别于指纹图谱的整体性分析方法。

本课题组在浙江丽水庆元百山祖（红杆）和温州永嘉四海山（绿杆）中发现了两种野生品种，通过多年的引种栽培发现在性状及抗逆性方面红杆型多花黄精均优于绿杆型，为丰富浙江产多花黄精种质资源库及选育品质更加优良的多花黄精品种，本研究采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术的植物代谢组学方法对丽水庆元百山祖（红杆）和温州永嘉四海山（绿杆）多花黄精药材的整体化学轮廓进行比较分析，通过主成分分析法进行比较研究，旨在研究不同种质浙产多花黄精化学成分差异，为后期的红杆型多花黄精品质评价及栽培育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器系统主要包括高效液相色谱和串联质谱Thermo LC-MS(Ulimate 3000LC,Q Exactive)，色谱柱：Hyper gold C18(100×2.1×1.9 mm)；离心机(Heraeus Fresco 17,Thermo Fisher Scientific)；天平(BSA124SCW，Sartorius)；研磨仪（JXFSTPRP-24，上海净信科技有限公司）；纯水仪（明澈D24UV，Merck Millipore）；超声仪（PS-60AL，深圳市雷德邦电子有限公司）。

甲醇（LC-MS级67-56-1），购自Merck(Darmstadt,Germany)；乙腈（LC-MS级 75-05-8），购自 Merck(Darmstadt,Germany)；甲酸（LC-MS级64-18-6），购自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)；超纯水（LC-MS级7732-18-5），购自 Merck(Darmstadt,Germany)；L-2-氯苯丙氨酸（纯度≥98%），购自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)。

1.2 试验材料

红杆和绿杆多花黄精分别于2019年10月底采自浙江丽水市庆元县百山祖乡(118°50'E,27°47'N)、温州永嘉四海山(120°43'E,28°29'N)，其生长年限为第3年。样品经浙江省亚热带作物研究所陶正明研究员鉴定为多花黄精。

1.3 农艺性状检测

于2019年10月初，每个种质随机选取生长良好、长势基本一致的100株不同种多花黄精定点定株标记。分别以直尺和游标卡尺测定株高、茎粗；以LI-3000C叶面积仪测定叶长、叶宽和叶面积；采集10片叶片采用叠加测定法测定叶厚；并采用潘德芳[16]的方法测定根茎多糖含量。在两个种质样地采集3个区域，每个区域至少10株重复，其中红杆和绿杆多花黄精分别做3次生物学重复。

1.4 色谱条件

柱温为40℃；流速300 μL/min；流动相组成A：水＋0.1%甲酸，B：乙腈＋0.1%甲酸；进样量为4 μL，自动进样器温度4℃，其中液相色谱流动相反应条件见表1。

表1 液相色谱流动相条件

1.5 质谱条件

正模式：加热器温度300℃；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.0 KV；毛细管温度：350℃；S-Lens RF Level，30%。负模式：加热器温度300℃；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.2 KV；毛细管温度：350℃；S-Lens RF Level，60%。扫描模式：一级全扫描(Full Scan,m/z 70～1050)与数据依赖性二级质谱扫描(dd-MS2,TopN=10)；分辨率：70000（一级质谱），17500（二级质谱）。碰撞模式：高能量碰撞解离(HCD)。

1.6 数据处理

使用Compound discoverer软件（Thermo公司）对LC-MS检测数据进行提取和预处理，整理成二维数据矩阵形式，包含保留时间(RT)、分子量(MW)、观察量（样本名称）、峰强度等信息。对QC样品的总离子流色谱图(TIC)色谱图进行重叠。多元分析采用SIMCAP 13.0软件，对不同类型多花黄精差异化学成分进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法辨别分析(OPLS-DA)，采用Sigmaplot 10软件作图。

2 结果与分析

2.1 红杆与绿杆多花黄精农艺性状及多糖成分含量比较分析

由表2可知，除株高、茎粗外，红杆多花黄精叶厚、叶长、叶宽、叶面积等农艺性状均显著优于绿杆型多花黄精，说明多花黄精不同种源之间差异较大。丽水产红杆多花黄精不仅叶厚、叶长、叶宽、叶面积农艺性状优势明显，且田间观察发现整齐性较高，生长比较稳定。

表2 不同多花黄精农艺性状差异比较分析

黄精多糖是多花黄精最重要的药用成分，据中国药典标准规定，合格黄精药材多糖含量不低于7%。由表3可以看出，两地产多花黄精多糖含量均达到药典规定的标准，其中红杆型黄精多糖含量高达11%以上，说明两产地多花黄精多糖含量差异较大。

表3 不同多花黄精种质多糖含量比较分析

2.2 红杆与绿杆多花黄精化学成分轮廓分析

采用LC-MS对红杆型与绿杆型多花黄精花样本进行分析，发现不同类型多花黄精中的化学成分种类基本相同，含量却有所差异。图1为多花黄精根茎总离子流图，由于多花黄精在正离子模式(ESI+)下离子化效果较好，QC样品总离子流色谱图稳定，导出的化合物灵敏度较高且样品重现性较好，因此本研究采用正离子模式进行检测分析。结合文献[17-18]，依据LCMS矩阵中的得保留时间注释来源、预测成分以及NIST11检索匹配进行指认，共鉴定出22种主要化合物，结果见表4。

表4 多花黄精根茎化学成分LC-MS分析

图1 QC样本总离子流色谱图(ESI+)

2.3 多花黄精样品主成分分析

将采集的不同地点多花黄精药材数据样本导入SIMCA-P 11.0软件，以样本的峰面积相对百分含量为特征值，将数据标准化后进行PCA分析。PCA为无监督的分析方法，可以反映数据的原始状态，同时反映组内和组间的差异；为了突出组间差异，便于后续寻找差异成分，采用有监督的正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)（图2）对数据进行分析。丽水庆元百山祖（红杆）和温州永嘉四海山（绿杆）多花黄精样本在主成分空间中的分布比较分散，浙江丽水与温州由于地理位置和气候条件的差异，不同地理特征种植区域样本处于主成分空间分布位置也不同，多花黄精化学成分组成及比例也具有一定的特征性，结果见图2。

图2 红杆与绿杆型多花化学轮廓的OPLS-D(左)和S-plot(右)得分(R2X=0.665,R2Y=0.997,Q2=0.982)

将2个产地的多花黄精药材样本数据标准化后进行PCA分析，所得到的载荷图如图3所示。从载荷图上可以看出69个组分峰分布比较分散，得分图中的G组与R组样品点之间的分布有所散离，说明两组样品之间的代谢产物存在一定的差异，但没有实现完全的分离，组内样品之间的样本点分布较为分散，R2和Q2是数据模型质量参数，R2＞0.5说明模型拟合效果好，且PCA得分图中所有样品均在95%置信区间。使用正离子模式数据生成的PCA模型的质量(R2=0.665,Q2=0.982)要优于负离子模式(R2=0.537,Q2=0.886)，样品的聚类分离效果也较好，该结果表明不同产地的多花黄精化学成分在组分和含量上差异较大，PCA载荷图分析结果与LC-MS分析结果相一致。

图3 不同产地多花黄精样品主成分分析载荷图

为防止发生过度拟合常用置换检验模型的有效性，若Q2值大于左边任意一个Y变量随机排列模型的Q2值，在Y轴上的截距小于0可认为该模型质量较好，没有发生过度拟合[19]。重复测试200次循环迭代置换检验结果图见图2，Q2的回归直线与Y轴的交点在负半轴，正离子模式Q2Y(cum)(0,0.988)，Q2(cum)(0,-0.0853)，说明建立的OPLS-DA模型是稳定可靠的，不存在拟合现象。因此，可用来探究红杆型和绿杆型多花黄精的化学成分及代谢物差异。

2.4 红杆与绿杆多花黄精差异代谢物分析

以OPLS-DA模型的VIP得分(VIP＞1)，并结合t检验(t-test)的结果P值(P＜0.05)来寻找两品种间的标志性差异代谢物。由表4可知，两种多花黄精样品中共筛选出22种代谢产物，其中筛选得到15种差异代谢物在红杆多花黄精中的相对含量高于绿杆多花黄精，说明两种多花黄精由于栽培地点及生态环境的差异，相同代谢产物的含量也有所差别，结果见表5。差异代谢物中，发现多种参与蛋白合成的氨基酸，如脯氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸存在显著差异，氨基酸是构成生物体蛋白质的基础物质之一，还具有滋补强身功效。另外，红杆品系多花黄精的柠檬酸显著高于绿杆，柠檬酸为一种抗氧化剂，有抑制细菌等作用。柠檬酸还具有螯合作用，能够清除某些有害金属。说明红杆多花黄精可能具有更强的抗逆性。

表5 红杆与绿杆多花黄精LC-MS分析差异代谢物的VIP值

3 讨论

3.1 红杆与绿杆型多花黄精农艺性状差异研究

本研究中，多花黄精的株高、叶面积等农艺性状及药用有效成分根茎多糖在不同种源间均达到显著或极显著差异，说明多花黄精不同种源间蕴藏着丰富的遗传变异，存在着较大的优良种源选择潜力[20]。研究表明多花黄精的叶面积与株高均呈极显著正相关，与根茎鲜质量呈显著正相关，这说明可以利用叶面积对高产多花黄精进行优良种源做初步选择；多花黄精根茎多糖含量与株高、茎粗均呈负相关，这意味着多花黄精生长的越快，其有效成分含量积累的越少[21-24]。笔者经过多年研究，成功的进行红杆多花黄精的引种，通过两地的种源比较分析，进一步表明红杆多花黄精品质优良。

3.2 红杆与绿杆型多花黄精差异化合物筛选分析

多花黄精野生资源主要分布在安徽、贵州、浙江、湖南、云南等地，近年来多花黄精人工栽培面积在浙江省逐年增加，而浙江不同产地多花黄精品质差异相关研究尚未见文献报道[25-26]。本研究通过表型鉴定发现浙江丽水庆元百山祖生长多花黄精多为红杆，而温州永嘉四海山所产则为绿杆，为了探究两地产多花黄精内在品质的差异，本研究利用LC-MS代谢组技术对两地采集的样本进行化学成分差异性分析。通过PCA主成分分析发现，两地产多花黄精药材中的化学物质成分种类和相对含量差异较大。红杆与绿杆型多花黄精的代谢轮差异明显，表明两者在化学成分上存在明显差异。12个多花黄精样本中共鉴定出22个化合物，两种质多花黄精化学成分的组分和代谢产物VIP值差异显著。分析结果表明，柠檬酸、苯甲酸、甲氧基水杨酸、L-色氨酸、5-羟甲基糠醛、脯氨酸、丙酮酸、L-赖氨酸、组氨酸和γ-亚麻酸乙酯等10类差异代谢物含量在两者间存在显著差异。这些结果表明红杆和绿杆型不仅在形态方面存在差异，其内在化学成分也不尽相同，红杆品系相比较绿杆有更佳的营养品质。据文献报道已知11月降水量、月降水量等环境因子是影响多花黄精分布的主导环境因子，而季节降水量变异系数和最暖季平均温对多花黄精的分布影响最小，这说明决定多花黄精能否在当地生长的主要因素是春秋二季月降水量，夏季的气候条件对多花黄精的影响较小[27-28]。尽管多花黄精的适宜栽培地区较为广泛，但是不同产地的降水量、气候以及土壤差异都会影响其内在品质。陈龙胜等对不同产地多花黄精挥发性物质研究表明湖北赤壁、湖北随州、湖北恩施和湖南岳阳所产多花黄精挥发性成分较为一致，但安徽所产多花黄精和湖北地区相比，所含化学成分存在较大差异，其中栽培基质对多花黄精生长及有效成分积累也有较大影响[29-30]。

4 结论

本研究采集了浙江2个产地不同区域的2种不同表型多花黄精种质，通过农艺性状比较研究显示丽水产红杆种质的叶厚、叶长、叶宽、叶面积和多糖含量等指标均显著优于永嘉产绿杆多花黄精，说明不同产区多花黄精不同种间差异较大。代谢组结果显示多花黄精样本共鉴定出22个化合物，2种质多花黄精根茎的柠檬酸、L-色氨酸、脯氨酸、L-赖氨酸、组氨酸等10差异代谢物含量存在显著差异，且以红杆种质含量较高。随着黄精人工栽培面积的快速增长，人们对黄精药材的要求已经不仅仅局限于“量”，从满足“健康中国”和“人民日益增长的美好生活需要”角度来看，黄精药材的品质更应得到关注。本研究结果对浙江产多花黄精的生态适应性评价和新品种选育具有重大意义。