FcRn对新型抗西尼罗河病毒单抗MIL94体内药代动力学的影响

相亚楠，王灵超，高 尤，张文鹏，庄笑梅

(1.天津大学化工学院，天津 300072；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850)

西尼罗热是由西尼罗河病毒引起的一种人畜共患性传染病，自1999年起首次在北美洲大面积流行[1]。目前无批准上市的疫苗及药物用于西尼罗河热的预防和治疗。虽然我国尚无该病的病例报告，但作为潜在的传染性疾病，亟需开发储备药物。MIL94是由军事医学研究院研究的全人源单克隆抗体，前期小鼠染毒试验结果显示能够全保护病毒感染(数据未公开)，正在进行系统的临床前药代动力学研究。

单抗药物(mAB)与传统的小分子药物相比，具有完全不同的理化特性，其分子质量、体积和极性都远远大于小分子。这些特性使得单抗药物在体内吸收、分布和消除等过程与小分子药物不同[2]。单抗的消除途径主要有3种：1)蛋白酶水解。单抗药物因相对分子质量较大不会经肾脏直接滤过，可在蛋白酶的作用下降解为肽段，被机体重新利用。这种水解是非特异性的，在单抗药物的消除中贡献率也比较低。2)免疫系统清除。机体的可溶性抗原与单抗结合形成免疫复合物，继而被免疫系统清除。同时单抗药物可能在体内引起免疫反应而产生抗药物抗体，单抗药物与之结合后随即被免疫系统清除。3)溶酶体水解。单抗药物可以与细胞表面膜结合型抗原结合或与细胞表面Fcγ(可结合IgG)受体结合后内吞至细胞内，也可以非特异性吞饮的方式进入细胞，然后被细胞内的溶酶体降解成肽段和氨基酸[3]。

新生儿受体(FcRn)是影响抗体半衰期的主要原因[4]。FcRn是由大小两个亚基组成的异源二聚体，大亚基分子量为45-53 ku，称为α链；小亚基是β 2微球蛋白(β2m)，分子量为14 ku，称为β链，两条链以非共价键的形式结合在一起。β 2微球蛋白对于FcRn功能有重要的作用，α链必须和β 2微球蛋白装配后才能发挥转运作用。α链与MHC I类分子一样，具有α1、α2和α3 3个胞外功能区、1个跨膜区和1个胞质尾区。由44个氨基酸残基组成的胞质尾区，可能含有介导胞内途径的信号[5]。FcRn与抗体或蛋白的结合具有pH依赖性，在生理pH为7.4时，FcRn不与IgG结合，但是在内涵体酸性(pH 6.0-6.5)的条件下，FcRn与核内体中IgG的Fc结构域结合，保护IgG不被降解，从而延长了IgG的血清半衰期。FcRn延长内源性IgG和白蛋白的循环半衰期的作用已经在体内外研究中广泛证实，在FcRn敲除小鼠体内内源性IgG和白蛋白的半衰期明显缩短[6-7]。IgG的Fc片段与FcRn受体结合起关键性作用，并且在Fc上特异性变异可以明显提高与FcRn的亲和力[8]，为单抗药物设计开发提供了优化方向。

本文拟在表达不同种属FcRn的小鼠体内进行MIL94的药代动力学研究，观察比较FcRn与MIL94体内消除和分布的关系，预期该抗体在人体内的药代特征。

1 材料与方法

1.1 实验仪器酶标仪(德国BMG LABTECH公司)；微量加样器(德国Eppendorf公司)；低温离心机(美国Thermo公司)；微量振荡器(广州SCILOGEX公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；小动物呼吸麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；洗板机(北京天石天力医疗器械技术开发中心)；96孔板(美国Thermo公司)。

1.2 实验药品与试剂MIL94单克隆抗体(浙江海正药业有限公司，批号：190401)；包膜蛋白(Envelope Protein，美国Sino Biological公司，批号：40345-V08Y)；羊抗人IgG-HRP(北京Solarbio公司，批号：SE101)，HRP为辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase)；TMB显色液(四甲基联苯胺，3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，美国Invitrogen公司，批号：00-4201-56)；包被液：碳酸钠碳酸氢钠缓冲液(碳酸钠、碳酸氢钠均为国药集团化学试剂有限公司)；PBS(美国Gibco公司，批号：C10010500BT)；洗涤液：PBST溶液(含0.05% Tween 20的PBS，Tween 20为国药集团化学试剂有限公司，批号：120216)；酪蛋白封闭液(美国SIGMA公司，批号：C5890)；促凝采血管(美国BD公司，添加SST Amber高分子凝胶促凝，批号：9136623)；静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG，Intravenous immunoglobulin，河北大安制药有限公司，批号：B20200201)；1 mL注射器(美国BD公司，批号：5232454)。

1.3 实验动物雄性C57野生小鼠10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。雄性hFcRn小鼠(只表达人FcRn不表达小鼠FcRn的转基因小鼠)20只，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2019-0002。雄性FcRn基因敲除小鼠(不表达FcRn基因的小鼠)5只，购自北京澄天生物科技有限公司，使用许可证号：SYXK(京)2018-0016。所有小鼠体质量均为(20-25)g。小鼠购入后饲养于军事医学研究院动物房，室温维持在(26 ± 2)℃，相对湿度(55 ± 5)%，12 h/12 h 光照/避光循环，实验期间动物自由取食、饮水，小鼠接受的所有操作均符合本单位实验动物伦理委员会规定(伦理号：IACUC-DWZX-2020-627)。

1.4 间接ELISA法测定小鼠血清MIL94浓度用包被缓冲液将抗原稀释到1 mg·L-1，96孔酶联板中每孔加入100 μL，4℃包被过夜。每孔加入200 μL封闭液，37 ℃孵育1 h。用空白混合小鼠血清稀释系列浓度(0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1)的MIL94制备成标准曲线样品，0.031 25、16 mg·L-1作为锚定点不参与定量，同法配制0.125、0.8、6.4 mg·L-1的MIL94质控样品，每孔加入100 μL，设置复孔，37 ℃孵育2 h。用二抗稀释液按1 ∶50 000稀释HRP标记的羊抗人IgG，每孔加入100 μL，37 ℃避光孵育1 h。加入TMB显色液，室温避光放置10 min。最后加入1 mol·L-1的 H2SO4终止液终止反应，用酶标仪于450 nm波长处测定OD值。将标准曲线样品浓度值(X)与所测定的吸光值(Y)利用 SPECTRO starNano软件的四参数法进行拟合。拟合方程为：Y = Bottom +(Top-Bottom)/(1+(EC50/X)^Slope)。其中Top为拟合曲线的上端渐进线的估计值(OD值)，Bottom为拟合曲线的下端渐进线的估计值(OD 值)，Slope为校正曲线的斜率，X为实测浓度，EC50为50%光吸收值所对应的样品浓度值，通过拟合最优的曲线作为校正曲线。

按照生物样品指导原则的要求，用该ELISA法对特异性、精密度、准确度、选择性、稀释线性、钩状效应、平行性和稳定性等进行全面验证。

1.5 实验设计

1.5.1给药方案 野生型小鼠(WT-C57)随机分成2组，每组5只，分别为静脉注射5 mg·kg-1和50 mg·kg-1的MIL94。于给药前及开始后10 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、72 h、120 h、144 h静脉采血。hFcRn小鼠随机分成4组，每组5只，分别为静脉注射5 mg·kg-1的MIL94、静脉注射50 mg·kg-1的MIL94、腹腔注射IVIG(1 g·kg-1)2 h后+静脉注射MIL94(5 mg·kg-1)、腹腔注射IVIG(1 g·kg-1)2 h后+静脉注射MIL94(50 mg·kg-1)。FcRn基因敲除小鼠5只，静脉注射MIL94(50 mg·kg-1)。hFcRn小鼠(无IVIG组)、FcRn基因敲除小鼠(FcRn-/-)采血点均为给药前及开始后10 min、1、2、4、8、12、24、48、72 h静脉采血。hFcRn小鼠(含IVIG组)采血点为给药开始后10 min、1、2、4、8、12、24、48、72、120、144 h。采血量约30 μL，置于促凝离心管中。

1.5.2血清样品的制备 全部血样均于室温凝固30 min后，4℃，2 500×g转速离心10 min获得血清，分装后于-40 ℃冻存，待测。

1.6 数据处理

1.6.1药代动力学参数计算 应用WinNonlin软件，按非房室统计矩模型计算静脉注射给药后小鼠的主要药代动力学参数：曲线下面积(AUC)，清除率(CL)，稳态表观分布容积(Vss)，消除半衰期(T1/2)和平均驻留时间(MRT)，采用 Microsoft EXCEL(2010)计算均值、标准差(s)，使用 GraphPad Prism 6 作图。

2 结果

2.1 MIL94在小鼠血清中ELISA定量方法的建立与验证MIL94在0.0625-8 mg·L-1范围内，浓度的对数值与吸光值(OD 值)呈S形曲线，定量下限为0.062 5 mg·L-1。加入Human IgG对MIL94浓度测定无干扰(特异性满足要求)。批内精密度波动在2.53%-7.69%。批间精密度波动在0.01%-8.33%之间。稀释线性的准确度90.42%-100.32%之间，无明显的钩状效应。选择性、平行性满足要求。样品冻存至14 d稳定。该方法灵敏度好，1 μL样品即可测定样品浓度，提示该方法可用于小鼠血清中MIL94浓度的定量检测。

2.2 静注MIL94(5 mg·kg-1)后不同组小鼠间药-时曲线及药代动力学参数静注MIL94(5 mg·kg-1)后不同组小鼠间药-时曲线及药代动力学参数见Fig 1及Tab 1。结果显示，静注MIL94(5 mg·kg-1)后野生型小鼠与人源化FcRn小鼠药-时曲线很相似，但hFcRn小鼠合用IVIG后血药浓度降低明显加快(Fig 1)。人源化FcRn小鼠与野生型小鼠相比，平均半衰期增加到2.1倍[(5.19±3.63)d与(2.43±0.25)d]，T1/2、AUC、Vss、CL、MRT差异均有统计学意义，提示在低浓度下，不同种属的FcRn对MIL94的半衰期有明显影响。hFcRn小鼠合用IVIG后与hFcRn小鼠未合用IVIG组相比，体内暴露量AUC明显减小，半衰期从5.19 d缩短至0.64 d，清除率从19.26提高至76.28 mL·d-1·kg-1，T1/2、AUC、Vss、CL、MRT差异均有统计学意义，提示hFcRn小鼠注射IVIG后，IVIG与体内的hFcRn发生结合，导致与MIL94结合的hFcRn减少，半衰期明显缩短。

Fig 1 Serum concentration-time curves of MIL94(5 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice n=5)

2.3 静注MIL94(50 mg·kg-1)后不同组小鼠间药-时曲线及药代动力学参数静注MIL94(50 mg·kg-1)后不同组小鼠间药-时曲线及药代动力学参数见Fig 2及Tab 2。结果显示，静注MIL94(50 mg·kg-1)后，hFcRn小鼠与野生型小鼠相比血药浓度降低略慢，而FcRn-/-小鼠和hFcRn小鼠合用IVIG后的药-时曲线几乎重合，药物体内血药浓度降低速度明显加快(Fig 2)。与野生型小鼠相比，MIL94在hFcRn小鼠体内的清除率降低，暴露量增多，提示hFcRn可能影响MIL94清除进而影响暴露。hFcRn小鼠合用IVIG组与hFcRn小鼠未合用IVIG组相比血药浓度降低，T1/2、Vss、CL差异有统计学意义(P<0.05)，提示IVIG通过影响FcRn与MIL94结合进而影响MIL94的分布和清除(Tab 2)。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of MIL94(5 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of MIL94(50 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice

Fig 2 Serum concentration-time curves of MIL94(50 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice n=5)

2.4 FcRn对MIL94体内消除和分布的影响将MIL94在不同组别小鼠体内的药代动力学参数进行横向比较，结果见Fig 3-5。结果显示MIL94的消除半衰期与FcRn的种属和功能密切相关。在不同品系小鼠相同剂量给药后半衰期有统计学差异，表达hFcRn的小鼠体内半衰期约为野生型小鼠的2倍，而在敲除FcRn基因小鼠体内半衰期明显缩短，与在hFcRn小鼠合用IVIG后的半衰期相当(0.5-0.6 d)。进一步将各组清除率数据进行横向比较发现，其组间差异的趋势与消除半衰期的关系相似。清除率在同种品系小鼠低剂量给药后无明显差别，高剂量给药后明显降低，总体趋势为在hFcRn小鼠体内清除率略低于野生型小鼠，而在敲除FcRn基因小鼠体内的清除率明显增加，并与在hFcRn的小鼠合用IVIG后的清除率相当(70 ～ 90 mL·d-1·kg-1)，是野生和hFcRn小鼠清除率的3 ～ 9倍。将各组稳态表观分布容积(Vss)数据进行横向比较发现，MIL94在各组小鼠的Vss都比较低，说明其组织分布较少。另外，在敲除FcRn基因小鼠体内其Vss与野生型小鼠相比降低2倍，在hFcRn的小鼠合用IVIG后Vss比合用前降低不到2倍，提示FcRn也在一定程度上影响MIL94的体内分布，进而影响暴露。通过上述比较研究发现，FcRn通过影响MIL94的体内消除和分布，改变其在不同种属中的半衰期。

Fig 3 The T1/2 of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

Fig 4 CL of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

Fig 5 Vss of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

3 讨论

随着生物医药在全球范围蓬勃发展，单抗药物已逐渐成为新药领域的重要组成。截止2020年4月底全球获批上市的单抗药品共计91个，并且近几年单抗药物上市明显加速。随着单抗药物在临床研究和应用的日益广泛，针对这类药物药代动力学机制和特征的研究更凸显其重要性。与小分子药物相比，单抗药物作用机制更加明确，其体内药效与药物暴露关系更加直接[9]，体内药代动力学特征很大程度上决定其药效发挥，因此评价和预测单抗药物的药代动力学特征至关重要。如果单抗药物在体内有效暴露量能够维持更长时间，可大大提高病人的顺应性并降低给药剂量，因此其体内半衰期是决定单抗药物药效的重要指标之一。大分子药物体内半衰期受到给药途径、药物体内分布及代谢清除等主要因素影响。MIL94是针对西尼罗河病毒设计的全新的人源化单抗药物，通过静脉注射入血中和病毒达到防治作用，目前在临床前研究阶段。MIL94体内半衰期的特征和机制研究将为其临床开发提供重要依据。

MIL94的分子量72 ku，大于肾脏滤过的低限分子量(50-60 ku)，且难以透过生物膜，其表观分布容积被细胞外的容积空间所限制[10]。由于其具有IgG结构特征，pH依赖的FcRn循环机制可能对其体内半衰期发挥重要作用。FcRn基因首次从大鼠细胞中分离出来，随后，小鼠、人、牛、猪等的同源基因陆续被分离鉴定，通过基因序列比对发现具有高度同源性。FcRn在多种组织器官中均有表达，但是其表达模式有一定的种属差异。鉴于FcRn对单抗药物半衰期的影响，已建立了体内外模型评价FcRn与mAB的亲和力，用于筛选和评价单抗药物。其中表面等离子共振技术(SPR)作为成熟的评估生物分子间相互作用的工具，是最常用的体外模型[11]。大部分研究结果表明，单抗药物与酸性条件下FcRn的结合作用与体内半衰期相关；但也有结果发现，与中性条件下与FcRn的解离作用更相关[12]；还有结果表明，一些单抗药物的半衰期与体外获得的FcRn亲和力并不相关[13]。体内模型包括应用与人同源性最高的非人灵长类动物以及转基因动物进行药代动力学研究。由于猴的来源比较有限，基因工程小鼠模型是重要的研究工具，常用的包括表达hFcRn的小鼠和FcRn敲除小鼠。IVIG是注射用免疫球蛋白，可以与hFcRn结合。研究表明，小鼠注射大剂量的IVIG后由于饱和了体内FcRn，也可以间接敲除FcRn功能[14]，并且表达hFcRn的小鼠注射1 g·kg-1的IVIG后，无不良反应，并且可以明显缩短单抗药物半衰期[15]。大量研究证明，hFcRn转基因动物体内的结果与猴及人体内的结果更加接近。因此在本研究中，首次同时应用野生型小鼠、FcRn敲除小鼠、表达hFcRn的小鼠以及表达hFcRn的小鼠合用IVIG后比较研究不同剂量MIL94的体内药代动力学特征，证明FcRn的作用及种属差异。MIL94作为一类新药，本课题组前期已经开展了MIL94在大鼠、食蟹猴体内低、中、高3个剂量(0.5-50mg·kg-1)的药代动力学实验，结果均显示线性清除(数据未公布)，推测MIL94在正常小鼠体内是线性清除。因此本研究中每组只设计了5-50 mg·kg-1两个剂量研究FcRn介导的种属差异。

结果表明，5-50 mg·kg-1剂量范围的MIL94在野生型小鼠和hFcRn的小鼠体内的药代动力学基本成线性过程。同时，各组动物体内的分布容积均略高于小鼠血浆容积(50 mL·kg-1)，说明其组织分布受限，但FcRn敲除小鼠的分布容积最小，提示FcRn也在一定程度上影响MIL94的分布。体内半衰期在不同组别之间有较大差异，提示FcRn参与MIL94的消除，并且有一定种属差异。在表达hFcRn的小鼠体内的半衰期比野生型小鼠更长，可能由于MIL94是全人源化的单抗，与hFcRn的亲和力比mFcRn的要强，但是由于FcRn与单抗的结合过程还受到很多因素的影响，具体机制尚需深入研究。

综上，本研究在表达不同种属FcRn的动物模型中研究了MIL94的药代动力学特征，获得了FcRn对MIL94体内分布和消除的影响，预测MIL94在人体内半衰期比动物长。靶点介导的消除(TMDD)是单抗药物体内的特异清除途径[16]，下一步将在病毒感染动物模型中开展MIL94的药代动学研究，进一步预测MIL94在临床患者体内的暴露特征。

(致谢：感谢佛罗里达大学生物统计博士Jack Yan在数据统计处理中给予的帮助。)