上皮黏附分子通过诱导EMT促乳腺癌转移和耐药

师锐赞，何倚帆，牛亚楠，高 宇，陈 敏，张轩萍

(山西医科大学基础医学院药理学教研室，山西 太原 030001)

乳腺癌是世界范围内的恶性肿瘤，是女性癌症相关的第一大死因，严重危害女性健康。近年乳腺癌的诊治已取得重要进展，但转移和耐药仍是多数乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌患者转移灶内肿瘤细胞的耐药性明显增强，治疗棘手，平均寿命仅2-3年[1]。因此，探寻与转移和耐药均相关的关键分子是改善乳腺癌预后的重要举措。

上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是表达于上皮细胞的I型跨膜糖蛋白，参与细胞黏附、迁移、增殖和分化等过程，在多种恶性肿瘤(如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等)呈异常表达。EpCAM对肿瘤干细胞的干性维持也有突出意义，是防治恶性肿瘤的新靶点[2]。研究证实[3]，EpCAM过表达是乳腺癌疗效差和预后不良的重要原因之一[3]，但其机制尚未阐明。本研究主要探究EpCAM在乳腺癌转移和耐药中的作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，Cellmax，货号：SA112.02)；乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP，Sangon Biotech，货号：D155255)；Transwell 24孔板(Corning，货号：3422)；Matrigel胶(Corning，货号：356234)；EpCAM多抗(Boster，货号：PB1115)；E-cadherin多抗(Boster，货号：PB9561)；N-cadherin多抗(Boster，货号：BA0673)；β-actin单抗(Boster，货号：BM0627)；vimentin多抗(ABclonal，货号：A19607)；β-catenin单抗(Santa Cruz Biotechnology，货号：8480)；active β-catenin 单抗(Cell Signaling Technology，货号：8814)；Lipofectamine 2000(Thermofisher，货号：11668-027)；siRNA序列设计及合成(Public Protein/Plasmid Library，货号：PPL0038-3a/b/c)。

1.2 主要实验仪器恒温培养箱(型号：371)购自美国Thermo公司；倒置显微镜(型号：AE2000)购自厦门麦克奥迪电气股份有限公司；超净工作台(型号：ZHJH-C1112C)购自上海智城分析仪器制造有限公司；Western blot凝胶成像系统(Biorad GelDoc XR)购自美国Bio-rad公司。

1.3 细胞培养人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞由中国医学科学院血液学研究所熊冬生教授馈赠，培养于含10% FBS的RPMI-1640完全培养基中，放置于37 ℃、含5%CO2的培养箱。

1.4 组织样本本研究收集2012年8月-2013年3月山西省肿瘤医院(太原，中国)行手术切除术的60例女性乳腺浸润性导管癌患者(临床Ⅰ～Ⅲ期，其中34例发生淋巴结转移，26例未发生淋巴结转移)，并收集距肿瘤边缘约5 cm非肿瘤癌旁组织(adjacent non-tumor tissues，ANTTs)。浸润性导管癌患者均为首次确诊，术前未进行放化疗。本研究经过山西医科大学伦理委员会的批准，按照《赫尔辛基宣言》及其后来修订的所有原则进行。所有患者均签署了知情同意书。

1.5 细胞转染将对数生长期MDA-MB-231细胞，按3.5×105个/孔种至6孔板。待其融合率达约70%时，用Lipofectamine 2 000将siRNAEpCAM 和阴性对照siNC(negative control, NC)转染至MDA-MB-231细胞中，72 h后行Western blot鉴定转染效率。siRNAEpCAM-1序列：5′-CTACAAGCTGGCCGTAAAC-3′；siRNAEpCAM-2序列：5′-GTTTACGGCCAGCTTGTAG-3′；siNC序列：5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGTT-3′。

1.6 免疫组织化学染色厚3 μm的组织切片脱蜡至水，用3%过氧化氢处理后进行抗原修复、10%山羊血清封闭后，加抗EpCAM抗体(1 ∶100稀释，阴性对照用PBS代替)，4 ℃孵育过夜，与二抗孵育后经DAB显色后镜下观察并拍照。

1.7 Transwell实验将Matrigel胶(1 g·L-1)包被Transwell小室(侵袭实验，不涂者用于迁移实验)，放置在24孔板内，无菌台内自然风干。将1×105(迁移)或2×104(侵袭)细胞接种于上室(培养基不含血清)。同时下室充入500 μL含10% FBS的培养基。培养24 h后，用0.1%结晶紫染色，倒置显微镜下计数并拍照(×100)。

1.8 Western blot法收集细胞，提取蛋白确定其浓度后，取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，半干法转至NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h、一抗4 ℃孵育过夜、二抗室温孵育1 h后，用增强化学发光免疫分析法凝胶成像，并利用Image Lab软件测定条带灰度进行量化。

2 结果

2.1 EpCAM在乳腺癌转移灶和三阴性乳腺癌细胞上调免疫组化结果显示，与ANTTs相比，EpCAM在乳腺癌组织表达增多(P<0.05)，转移灶内进一步上调(P<0.01)(Fig 1A, B)；相对于乳腺癌 MCF-7 细胞，EpCAM表达在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞上调(P<0.05)(Fig 1C, D)。

2.2 敲低EpCAM抑制MDA-MB-231细胞的迁移siRNA法靶向敲低MDA-MB-231细胞的EpCAM表达，Western blot检测结果表明，与MDA-MB-231空白对照组相比，siNC组EpCAM表达变化不明显，而敲低组siEpCAM-1和-2中EpCAM表达分别降低24.4%(P<0.05)和49.0%(P<0.01)(Fig 2A，B)。与EpCAM的干扰效率相一致，siNC组细胞的迁移和侵袭能力相对于空白对照组未发生明显变化，而敲低组siEpCAM-1和-2的迁移和侵袭能力降低(Fig 2C)。

Fig 1 EpCAM is upregulated in metastatic breast cancer tissues and MDA-MB-231 cells

Fig 2 Migration and invasion ability of MDA-MB-231 cells inhibited by EpCAM knockdown

2.3 敲低EpCAM抑制BCRP介导的乳腺癌细胞耐药相对于MCF-7细胞，MDA-MB-231细胞的BCRP表达上调(P<0.01)(Fig 3A，B)，而敲低组MDA-MB-231-siEpCAM-2中的BCRP表达明显下调(P<0.01)(Fig 3C，D)。

Fig 3 BCRP expression in MDA-MB-231 cells reduced by EpCAM knockdown n=3)

2.4 敲低EpCAM逆转三阴性乳腺癌细胞的上皮间质转化相对于MCF-7细胞，MDA-MB-231细胞的E-cadherin下调、N-cadherin和vimentin上调(3者均P<0.01；Fig 4A，B)。与空白对照组MDA-MB-231细胞相比，阴性对照组MDA-MB-231-siNC上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin变化不明显(P>0.05)，而敲低组MDA-MB-231-siEpCAM-1和-2均可上调E-cadherin(P<0.05和P<0.01)，下调N-cadherin(P<0.01)和vimentin(P<0.01)(Fig 4C，D)。

2.5 EpCAM促乳腺癌转移和耐药与Wnt/β-catenin通路有关相对于MCF-7细胞，Wnt通路的核心分子β-catenin在MDA-MB-231细胞上调(P<0.05；Fig 5A，B)；Wnt通路的特异性抑制剂 ICG-001(5、10 μmol·L-1)明显抑制了非磷酸化的(active)β-catenin表达(P<0.05，P<0.01)，同时下调EpCAM(仅10 μmol·L-1P<0.01)、N-cadherin(P<0.05)、vimentin(P<0.01)表达(Fig 5C，D)。

Fig 4 EMT phenotypes in MDA-MB-231 cells partially reversed by EpCAM knockdown

Fig 5 EpCAM upregulated and EMT promoted by Wnt/β-catenin signaling in breast cancer n=3)

3 讨论

EMT是多种肿瘤转移侵袭的主要机制。EMT促进乳腺癌扩散到肝脏、肺或骨髓，是乳腺癌预后不良的重要原因[4]。BCRP过表达是乳腺癌耐药的重要机制[5]。近年研究证实，EMT与BCRP介导的肿瘤耐药也密切相关。肝癌和乳腺癌细胞EMT发生过程中，BCRP特异性上调[6-7]。本研究发现，相对于乳腺癌MCF-7细胞，三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的EMT表型明显，且BCRP过表达，进一步证实了EMT与乳腺癌转移和耐药的相关性。因此，本研究选用侵袭和耐药程度不同的两种乳腺癌细胞，从EMT着手，探寻与乳腺癌转移和BCRP介导的耐药均相关的关键分子，以期为恶性乳腺癌的诊断和治疗提供重要的分子靶点。

研究证实[8-9]，EpCAM可促进EMT发生。在鼻咽癌、结直肠癌细胞过表达EpCAM均可诱导EMT发生。敲低前列腺癌细胞EpCAM可抑制其干性和侵袭力[10]。但迄今尚无研究证实EpCAM在BCRP介导的肿瘤耐药中的作用。本研究证实，EpCAM在乳腺癌患者转移灶和三阴性乳腺癌细胞高表达；敲低EpCAM可降低MDA-MB-231细胞的转移和侵袭能力，减少其BCRP表达，并逆转其EMT。由此，我们推断EpCAM可能通过诱导EMT促进乳腺癌转移和BCRP介导的乳腺癌耐药。

EpCAM促进乳腺癌转移和侵袭的分子机制值得进一步探讨。Wnt/β-catenin信号通路是参与肿瘤发生发展、转移和耐药等的经典信号通路，EpCAM被证实为该通路的靶点之一[11]。正常情况下，β-catenin连接上皮标志物E-cadherin至细胞骨架。Wnt通路被激活时，β-catenin入核致E-cadherin下调，诱导EMT发生，同时促进其靶基因(包括BCRP)的转录[12]。本研究结果也表明，与MCF-7细胞相比，MDA-MB-231细胞中 β-catenin 表达显著升高；Wnt/β-catenin通路特异性抑制ICG-001可下调MDA-MB-231细胞的EpCAM和间质标记物(N-cadherin、vimentin)。这些结果均提示Wnt/β-catenin 信号通路参与EpCAM对乳腺癌转移和耐药的调节。

综上所述，耐药和转移是影响乳腺癌预后的两大因素，也是临床上亟待解决的关键问题。本研究证实，EpCAM可诱导EMT，上调BCRP表达，是关联乳腺癌转移和耐药的关键分子，且作用与Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究从分子水平阐明乳腺癌耐药和转移的关联机制，为临床上恶性乳腺癌的有效防治提供新思路和药物作用的新靶点，具有重要的理论和临床意义。