基于ISSR-PCR的长白落叶松种子园单株遗传多样性分析

邱新宇 张含国 黎家俊 玉苏普·赛迪艾合麦提胥丽雅 张素芳 张磊

摘要：  以长白落叶松无性系种子园347个单株为试验材料，利用ISSR-PCR分子标记技术分析其遗传多样性的结果表明，长白落叶松种子园单株具有丰富的遗传多样性。11条引物共扩增出172条谱带，其中，多态性谱带169条，多态位点比率为98.26%，基因多样性指数0.285 5，Shannon多样性指数0.479 5～0.520 4，Nei's 指数0.064 0～0.436 0。

关键词：  ISSR;  长白落叶松;  单株;  遗传多样性

中图分类号：   S 791. 22， S 722. 7                  文献标识码：   A                  文章编号：1001 - 9499（2019）02 - 0023 - 03

长白落叶松（Larix olgensis）为松科落叶松属，主要分布于东北林区，其速生性、耐腐性和力学特性优于其他松科植物，常作为木材工业原料使用，是我国主要的造林树种之一。不同物种的遗传物质是不同的，在特定的环境条件中，通过群体的遗传多样性研究可以了解物种遗传物质的丰富程度[ 1 - 2 ]。物种的遗传多样性越丰富，适应环境变化的能力就越强，越不容易灭绝[ 3 ]。DNA标记是目前最有效的遗传多样性研究方法，其中，ISSR分子标记简单便捷、开发成本低，被广泛应用于遗传多样性研究中。本研究以黑龙江省林口青山林场的长白落叶松种子园为研究对象，在DNA水平上研究长白落叶松无性系种子园的遗传多样性，以此了解长白落叶松对环境的适应能力，为种质资源亲缘关系的鉴别、评价和利用提供参考依据。

1 试验材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料源于牡丹江林口县青山林场，采自1994年定植的长白落叶松无性系种子园第78区的347个单株。2016年6 月下旬，采取当年生幼嫩针叶，分袋装好并标记，置于冰箱-80℃冷冻保存，用于提取样本总DNA。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取

使用新型植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司生产）提取长白落叶松样品总DNA。

1. 2. 2 DNA质量检测

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及紫外吸收法检测DNA 质量。根据DNA凝胶条带判断DNA的完整性，若窄带集中，说明DNA完整性较好。利用分光光度计测定DNA浓度与纯度，为保证后续试验顺利进行，浓度需大于200 ng/ul，OD260/OD280=1.8～2.0。将已提取的DNA模板置于-40℃冰箱保存待用。

1. 2. 3 引物筛选

以100条试验室已有引物（来源：林木遗传育种国家重点试验室的ISSR引物，部分加拿大哥伦比亚大学公布的第9套ISSR引物序列）为筛选目标，随机选取4个单株作为引物筛选样品。

1. 2. 4 ISSR-PCR反应体系和扩增程序

根据PCR电泳结果选择谱带清晰的引物，按照落叶松ISSR-PCR反应体系和扩增程序[ 8 - 10 ]，随机选用不同样品进行PCR扩增。在1×TAE缓冲液中，将扩增产物用含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，在紫外灯下拍摄保存记录结果。

1. 2. 5 分子标记数据统计与分析

参照电泳图谱中分子量标准，分析PCR 扩增产物片段的大小，推算扩增产物的分子量。有DNA条带的记为“1”，无DNA条带的记为“0”。利用 Popgene32软件计算得到供试材料的等位基因数、有效等位基因数、Nei's基因多样性指数、Shannon 多样性指数等相关参数[ 11 - 12 ]。

2 结果与分析

2. 1 DNA质量检测

由DNA 琼脂糖检测结果（图1）可以看出：窄带比较集中，提取的长白落叶松DNA样品质量较好，其浓度及纯度均符合试验要求。

2. 2 引物筛选

根据电泳结果，选择条带清晰、差异明显、重复性和稳定性较好的引物进行遗传多样性分析，从100个引物中共筛选出了11个引物，引物编号及序列见表1。

2. 3 ISSR-PCR扩增

多态位点比率反映了群体遗传变异水平的高低，对环境适应能力强的群体多态位点比率也比较高。利用11个引物对长白落叶松无性系347个单株的DNA 样品进行ISSR-PCR 扩增，共检测到 172个位点，位点范围为100 bp～3 000 bp。每个引物平均扩增 15.63个条带，多态位点有169个，多态位点比率高达 98.26%。其中，引物900扩增位点最多，有20个位点，多态位点百分率为55%;引物854多态位点最少，有11个位点，多态位点百分率为63.64%。

2. 4 单株遗传多样性分析

由单株遗传多样性分析结果（表4）可以看出：（1）单株等位基因平均数范围为1.000 0～2.000 0，有效等位基因數变动范围为1.000 0～1.999 9。14、44、45号3个单株有效等位基因数最低，其值均为1.000 0，第143株有效等位基因数最高，其值为1.999 9。（2）基因多样性指数最大为0.500 0，最小为0.000 0;Shannon指数最大为0.692 6，最小为0.000 0，单株间遗传变异变化幅度为0.479 5～0.520 4，不同单株遗传变异变化幅度为0.064 0～0.436 0，种群总体遗传变异平均值为0.285 5，试验样本种内单株之间的遗传变异明显，群体分化强烈。（3）遗传距离范围为0.017 6～0.658 9，347个长白落叶松单株的亲缘变化幅度较大。

3 结论与讨论

本次对长白落叶松种子园单株样本进行ISSR标记，共检测到 172个位点，多态位点比率为98.26%，表明长白落叶松不同单株间相似度低、多态性高，单株之间的遗传变异明显，群体分化强烈，个体间的亲缘关系变幅较大。据此可以判断，长白落叶松种子园单株遗传多样性较高，可提供大量无亲缘关系的优良种子。

参考文献

[1] Soltis PS， Slotis DE.Genetics variation in endemidc and widespread plant species： Examples from Szxifragaceae and Polystichum. Aliso， 1991， 13： 215 - 223.

[2] 林萍，  张含国，  谢运海.  正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系.  生物技术，  2005，  15（5）：  34 - 37.

[3] 马丽，  侯乐峰，  郝兆祥，  等.  82个石榴品种遗传多样性的ISSR分析[J].  果树学报，  2015，  32（5）：  741 - 750.

[4] Akhare A， Sakhare S， Kulwal P， et al.RAPD profile studies in Sorghum for identification of hybrids and their parents[J].Int J Inter Biol， 2008， 3（1） ： 18 - 24.

[5] 钱韦，  葛颂，  洪德元.  采用RAPD和ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性[J].  植物学报，  2000，  42：  741.

[6] Ge X J， Sun M. Reprodutive biology and genetic diversity of a cryptoviviparous mangrove Aegiceras corniculatum （Myrtinaceae） using allozyme and intersimple sequence repeat （ISSR） analysis[J]. Mol E col， 1999， 8： 2 061.

[7] 胡连清，  王清明，  丁显平，  等.  极危物种——南川木波罗遗传多样性ISSR分析[J].  四川大学学报（自然科学版），  2018，  55（04）：  865 - 872.

[8] Camacho F J， Liston A. Population structure and genetic diversity of Botrychium pumicola（Ophioglossaceae） based on inter-simple sequence repeats （ISSR）[J]. Am J Bot， 2001， 88： 1 065.

[9] 郭艳，  洪建聪，  陈铌铍，  等.  白及遗传多样性的ISSR分析[J].  中成药，  2018，  40（09）：  2 020 - 2 024.

[10] 姚宇，  张含国，  张振，  等.  去劣疏伐对长白落叶松初级无性系种子园SSR遗传多样性的影响[J].  中南林业科技大学学报，  2013，  33（03）：  40 - 46.

[11] 于大德.  华北落叶松种子园遗传多样性及亲本分析[D].  北京林业大学，  2014.

[12] 范英明.  华北落叶松天然群体SSR标记遗传多样性分析[D].  北京林业大学，  2014.

第1作者簡介：  邱新宇（1996-），  女，  本科，  研究方向：  林木遗传育种。

通讯作者：  张含国（1962-），  男，  教授，  博导，  研究方向：  林木遗传育种。

收稿日期： 2019 - 01 - 06

（责任编辑：   王 岩 ）