两种操作方法在EBER原位杂交染色中的比较与应用

李真真，王九菊，马钰*

（1陕西省人民医院病理科，西安 710068；2陕西省人民医院血研室，西安，710068）

EB 病毒 ( Epstein-Barr virus，EBV) 越来越受到人们的关注，这不仅因为它以潜伏感染的形式广泛存在于健康人群，更重要的是它与越来越多的恶性肿瘤关系密切[1]。EB病毒编码的小RNA(Epstein–Barr virus-encoded small RNAs，EBER)在被感染的细胞核中以高拷贝数存在[2]。因此，EBER的相关检测已经成为EB病毒最重要的检测手段。EBER 显色原位杂交技术（chromogenicin situhybridization，CISH）具有定位作用，能够确定病毒与组织和细胞关系，EBER 原位杂交已成为公认的标准方法[3]。目前在各大中型医院中，EBER原位杂交主要采用的是手工染色的方法。随着全自动免疫组化染色机的广泛应用，EBER原位杂交也逐渐应用全自动免疫组织化学染色机进行。我们通过对两种不同染色方法的对比研究，发现应用全自动免疫组织化学染色机的方法用时短，定位准确，对比鲜明，明显优于手工染色。

材料与方法

1 标本来源

选取陕西省人民医院病理科EBER原位杂交阳性病例35例，其中胃髓样癌1例，鼻咽癌16例，NK/T细胞淋巴瘤5例，Burkitt淋巴瘤2例，胃腺癌2例，弥漫大B细胞淋巴瘤2例，血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤2例，经典型霍奇金淋巴瘤2例，淋巴组织不典型增生2例，急性重症EBV感染1例。每例切片两张，厚度4μm，分为仪器组和手工组。仪器组用全自动免疫组织化学染色机进行染色，手工组用手工染色的方法进行染色。

2 仪器设备

全自动免疫组织化学染色仪购自罗氏诊断公司，仪器型号为BenchMark XT。孵育盒、恒温箱、杂交仪。

3 试剂

仪器组试剂为罗氏诊断公司生产的ISH Protease 3、INFORM EBER Probe、iVIEW Blue Detection、ISH Red Counterstain。手工组试剂为福州迈新公司生产的EBER检测试剂盒。

4 EBER原位杂交全自动免疫组织化学染色机操作方法

①将切片经65℃烤片20min；②在电脑上选定染色项目为EBER，并输入相应的病理号，打印标签；③将标签贴于对应的切片上，将贴好标签的玻片放置于全自动免疫组化染色机的染色板上；④将染色过程所需要的试剂放置于染色架上，并检查试剂瓶口是否有空气柱和试剂结晶，检查后将染色架放于染色机相应位置上；⑤开始运行程序，染色机全程自动染色，时长约5h；⑥染色结束后将切片从染色机中取出，充分洗涤，晾干后封片。

5 EBER原位杂交全自动免疫组织化学染色机染色程序

①脱蜡；②罗氏CC1缓冲液环境下细胞修复60min；③加入ISH Protease 3，消化20min；④加入EBER探针；⑤加入iVIEW blue试剂盒：Ivew Anti-fluorescein 孵育 20min，iview blue biotinylated lg孵育8min，iview blue SA-AP, 孵育16min；Ivew blue enhancer 孵育8min；Ivew blue NBT和BCIP孵育32min；⑥加入红染试剂 Red Stain，孵育4min；⑦常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

6 EBER原位杂交手工染色方法

①将切片经65℃烤片20min；②切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡至水；③组织滴加适量的消化酶，室温下在湿盒中孵育3～7min（具体消化时间根据组织而定）；④蒸馏水漂洗，梯度乙醇脱水（75%、90%、100%各2min）;⑤组织干燥后，在切片样本区域滴加适量的EBER探针，加盖盖玻片，并密封盖玻片；⑥置于杂交仪或恒温箱孵育盒中，37℃孵育14～18h；⑦移去盖玻片，PBS缓冲液漂洗后滴加适量的鼠抗地高辛抗体，37℃湿盒中孵育30min；⑧PBS冲洗，滴加适量DAB显色液，室温下湿盒中孵育5min，自来水洗去显色液；⑨苏木素复染，脱水，透明，封片。

结 果

对两组切片的染色效果进行比较发现，仪器组（图A1、B1、C1、D1）35例染色均为阳性，阳性信号位于细胞核，为蓝色，背景色为淡红色，位于细胞质，颜色对比鲜明，较易判读。手工组（图A2、B2、C2、D2）35例染色均为阳性，阳性信号位于细胞核，呈棕黄色，背景色为淡蓝色，同样位于细胞核，背景色与阳性信号位于同一部位，对于阳性信号较弱的病例不易判读。比较同一病例的仪器组和手工组的染色结果，可以看出，信号较强时，两种方法都可以比较容易的判断出阳性的结果，并计算出拷贝数。但在信号较弱时，手工组由于背景的影响，判读和计数都较仪器组困难（图C2）。

对两种染色方法用时比较显示，仪器组全程染色时间约5h，整个流程均由仪器独立完成，无需技术人员操作，耗时短，且节约人力。手工组全程染色时间约为16h，每隔20～30min需要技术人员滴加各种试剂，且需要37℃过夜孵育最少14h，当天无法完成染色，与仪器组比较更加耗时耗力。

讨 论

图1 两组切片的染色效果进行比较。A，Burkitt淋巴瘤标本EBER原位杂交阳性；B，胃髓样癌标本EBER原位杂交阳性；C，鼻咽癌标本EBER原位杂交阳性；D，NK/T细胞淋巴瘤标本EBER原位杂交阳性（A1，B1，C1，D1为仪器组，A2，B2，C2，D2为手工组）；比例尺，100μmFig.1 Comparison of two methods in EBER staining. A, EBER is positive for in situ hybridization in Burkitt lymphoma specimens; B, EBER is positive for in situ hybridization in medullary carcinoma; C, EBER is positive for in situ hybridization in NPC specimens; D, EBER is positive for in situ hybridization in NK/T cell lymphoma specimens (A1-D1 is the instrument aided group, A2-D2 is the manual group); scale bar, 100μm

爱泼斯坦-巴尔病毒( Epstein-Barr virus，EBV)是一种广泛存在的γ-疱疹病毒[4]，主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。它不仅以潜伏感染的形式广泛存在于健康人群，更重要的是它与越来越多的恶性肿瘤关系密切[1]。有研究显示，在扁桃体炎患者的扁桃体组织内可以检测到EBV的基因[5]。另一些研究显示，在鼻窦内翻性乳头状瘤患者中，有30%的病变组织中检测到EBV病毒[6]。 更多的研究表明，EBV与某些类型的淋巴瘤有密切的关系。几乎所有的结外NK/T细胞淋巴瘤为EBV阳性，在血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤中也是如此。地方性Burkitt淋巴瘤几乎在所有病人的恶性细胞中均可发现EBV的复制，霍奇金淋巴瘤的恶性细胞—R-S细胞中的EBV阳性率为40%[7]。最近的研究显示，EBV阳性的弥漫大B细胞淋巴瘤，未特指型（DLBCL,NOS）是一种与EBV感染相关的淋巴瘤，标准化疗方案预后不良[8]。除了淋巴瘤外，有研究显示EBV感染是胃癌的另一个危险致病因素，病毒蛋白、EBER非编码RNA和EBV miRNAs可以通过调节宿主基因组甲基化和基因表达而参与肿瘤的发生[9]。另外，有研究显示，一种少见的肺肿瘤-原发性肺淋巴上皮瘤样癌与EBV感染密切相关，与鳞癌相比，预后较好[10]。综上所述，EBV的检测不仅越来越多的应用于部分疾病的诊断，同时也能起到提示预后、指导治疗的作用，因此，日益受到重视。目前，EBV病毒的检测已经成为病理科用于某些疾病的辅助诊断，以及淋巴结反应性增生、淋巴瘤诊断分型的重要手段之一。

EBER特异序列的单链DNA探针能特异性地与EBER靶序列互补杂交，从而检测EBV是否存在，且此方法用于检测石蜡组织切片中的EBV具有极高的特异性和灵敏性。因此EBER原位杂交已成为组织和细胞中EBV的标准检测方法[1]。EBER原位杂交是一项要求较高的实验室技术，过程繁琐，存在不稳定因素和人为差异[11]。此项技术应用的初期，大部分实验室采用手工的方法进行染色，随着科学技术的发展，各大中型医院病理科的仪器设备自动化程度越来越高，随着病理工作量不断增长，传统的手工操作已经难以满足工作需要，逐步被全自动化仪器操作取代[12]。

自动免疫组织化学染色机在EBER染色中的应用实现了自动化、规范化、标准化，避免了手工染色的人为误差，使染色结果更加稳定。手工染色的灵活性更高一些，可以根据不同的组织类型在染色过程中进行适当的调整，与机器染色相比较，更加的节省试剂。机器染色和手工染色各有其优缺点。①染色信号：仪器组染色结果阳性信号呈蓝色，位于细胞核，背景呈红色，位于细胞质。颜色对比鲜明，色差明显，不易误判。手工组染色结果阳性信号呈棕色，背景呈蓝色。阳性信号与背景色着色部位均在细胞核。如苏木素复染过深则容易将弱阳性信号覆盖，导致误判。②染色时间：仪器组染色全程约需要5h，手工组染色全程约需要16h。仪器染色不仅缩短了染色时间，而且可以在做EBER染色的同时进行免疫组化染色，提高了工作效率，有利于诊断报告的及时发出。③染色流程：仪器组在设定好染色程序之后，所有切片的染色流程均按照染色程序严格执行，每一张切片均有独立控温加热板，能够保证染色过程中温度与时间的控制，且切片不易被污染，实验结果一致性较高。手工组进行染色时实验操作人员易受外界因素的干扰，标本量较多时无法保证每一例标本的消化时间完全相同，因此容易造成人为误差；我们的实验中，就出现过因为操作人员实验条件和过程的把控失误造成手工染色失败的情况。④试剂的使用量：罗氏全自动免疫组织化学染色机采用油膜封盖技术，每张切片单种试剂的加样量为100μl，此技术可保证试剂均匀覆盖于整张切片上，无论组织大小与多少，均能保证切片的染色质量。手工组染色试剂直接滴加于组织上，如组织取材过大，则试剂的消耗量也相应的增加。⑤试剂成本：仪器组试剂成本比较昂贵，且需要借助于全自动免疫组化染色仪进行染色。手工组试剂相对价格比较低廉，更适合于基层医院开展。⑥粘附载玻片的要求：仪器组对载玻片要求较高，只有正离子浓度较高的粘附载玻片才能达到最理想的染色效果，一般的粘附载玻片在染色前需经脱脂奶粉处理增加正离子浓度后才可进行上机染色，否则容易出现假阴性结果。手工组则对粘附载玻片没有太多的要求，只要在染色过程中有足够的粘附性，不掉片即可。⑦阳性及阴性对照的设置[13]，无论是仪器组还是手工组均需设置阳性对照和阴性对照，仪器组可以将对照组织与待测组织裱于同一张玻片上，相同的试剂量可以保证所有组织的染色，手工组则需要在对照组织和待测组织上分别滴加试剂，每一批次都会增加两份试剂的使用量。

综上所述，EBER检测结果对一些疾病的诊断及治疗有重要的指导意义，在病理科的日常工作中的应用越来越广泛。快速、准确的检测是相关病理诊断的必要条件。仪器染色和手工染色各有其优缺点，我们在实际工作中可以根据各自实验室的具体条件合理选择适合自己的染色方法。仪器染色适合标本量大，技术人员少的医院开展，手工染色则比较适合基层医院开展。