某猪场猪繁殖与呼吸综合征分析

文│贾义平 李翠玲 樊祜卿（山东省菏泽市动物疫病预防控制中心）

赵鲁菏（山东省菏泽市行政审批踏勘评审中心）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病。该病具有持续性感染的特征，猪群一旦感染该病，PRRSV将长时间存在于猪群中，引起母猪妊娠后期流产、早产、死胎、木乃伊胎等生殖障碍和新生及断奶仔猪咳嗽、呼吸困难等呼吸症状。1996年，郭宝清等首次分离出我国PRRSV CH1-a毒株，随后我国各地均有PRRSV的检出，严重阻碍了我国养猪业发展，给各地养殖场户造成较大的经济损失。

防控PRRS重在接种疫苗达到免疫保护的效果，但PRRS核苷酸及氨基酸序列极易发生变异、重组，影响病毒的抗原性和致病力，尤其是PRRSV-ORF5基因变异频率最高，造成多个谱系的流行，从而导致现有的商品化疫苗免疫效果不佳甚至免疫失败，给防控PRRS带来困难。本研究通过对山东菏泽某规模化猪场开展PRRS血清流行病学调查以及对疑似患PRRS猪的肺和流产胎儿胎衣进行病毒RNA的提取，RT-PCR扩增PRRSV-ORF5，选取阳性PCR产物进行克隆测序，与PRRSV代表毒株的序列进行比较，给当地疫苗选择提供理论基础，为当地该病的防控提供参考依据。

一、材料与方法

1.发病猪场概况。山东省菏泽市2000头一点式自繁自养场，配种、产房、保育、育肥各栋舍间距离较远，中间无实体围墙隔离。猪场圈舍设计为余氏猪场设计，猪舍温控全部采用全自动控制，铺设有地暖。采用4周批的批次化生产模式。130～150日龄育肥猪厌食、精神沉郁、呼吸困难、日增重不同程度减少，发病率30%左右，死亡率约4%；母猪出现流产、产死胎现象，而后陆续转到仔猪和保育舍。该场使用的疫苗毒株为某公司生产的CH1-R毒株疫苗，免疫程序为商品猪21日龄肌内注射免疫，后备猪21日龄和145日龄肌内注射免疫，种猪普免2次/年。

2.样品采集。采集疑似PRRS的猪肺和流产胎儿胎衣共6份样品，置-80℃保存备用。前腔静脉采集表面健康猪只血液5～8毫升，自然静置2小时凝固，析出血清，共采集240份（其中待配35份、妊娠35份、后备35份、仔猪50份、保育45份、育肥40份），-20℃保存备用。

3.主要试剂及仪器。天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，cador pathogen 96 QIAcube HT Kit，DNA扩增试剂2×Taq Master Mix（Dye Plus），RNA扩增试剂Primerscript one step RT-PCR Kit购自天根生化科技有限公司，蓝耳病毒抗体ELISA试剂盒（国产）购自科前生物，东胜基因扩增仪，酶标仪Thermo Fisher。

4.检测方法。样品检测方法及结果判定参照试剂盒说明书。

5.序列及数据分析。运用DNA Star软件对ORF5基因序列与GeneBank上收录的PRRSV-ORF5基因序列进行同源性分析，并绘制进化树。PRRSV参考毒株为R98、CH1-a、CH1-R、VR2332、GD2008、HUN4、JXA1-P80、TJ-M、NADC30、JL580、GM2、GD-ZQ-2014。使用Excel软件对试验数据进行统计分析。

二、结果

1.PRSSV-ORF5基因的扩增结果。用PRRSV ORF5基因特异性引物对采集的6份疑似PRRS样品进行RT-PCR扩增，经检测共4份病料为阳性，扩增出大小为447bp的ORF5基因片段，编号分别为SD-HZCW1（2泳道）、SD-HZCW2（4泳道）、SD-HZCW3（5泳道）、SD-HZCW4（6泳道）。结果见图1。

◎图1 PRRSV ORF5基因扩增结果

2.PRSSV-ORF5基因序列分析。选取2个阳性样品（SDHZCW3、SD-HZCW4）进行PRRSVORF5基因测序。结果表明，所测2株核苷酸序列同源性为100%。与国内外已发表的参考毒株ORF5基因序列进行同源性对比（见表1），结果表明，所测样品的ORF5基因与国内外已报道毒株的基因序列同源性为82.5%～99.5%。其中与R98同源性最高为99.5%，与GM2同源性最低为82.5%。

表1 PRRSV-ORF5基因同源性分析%

3.遗传进化树分析。运用DNAstar软件，将样品SD-HZCW3的ORF5基因序列与国内外参考毒株序列进行比对，绘制遗传进化关系图（见图2）。通过比较发现，与VR2332为代表的谱系5（亚系5.1）的亲缘关系较近。

◎图2 PRRSV ORF5基因核酸遗传进化树

4.不同猪群抗体检测结果。该场共检测血清样本240份，总体血清抗体阳性率为81.18%。其中，抗体阳性率，育肥猪最高为96%，其次是后备母猪为93.52%，仔猪最低为54.22%。血清抗体S/P值，育肥猪最高为2.1，其次是后备母猪为1.78，仔猪最低为1.18。血清抗体离散度，育肥猪最低为25.29%，其次是后备猪为33.48%，仔猪最高为50.26%。

三、分析与讨论

PRRSV主要分为两个基因型，分别以基因1型（Lelystad病毒）和基因2型（VR2332）为代表，1型主要分布在欧洲，2型主要分布在北美洲和亚洲。其中，亚洲2型PRRSV的出现主要是由北美谱系的引入导致，该谱系在我国发生多样性变异，进而导致该病的暴发和毒力增强。自1996年首次报道PRRSV以来，我国PRRS的流行主要分为两个阶段，到2006年Tian T等分离出高致病性PRRSV之前为传统PRRS流行阶段，之后我国开始进入猪PRRS暴发时期，高致病性PRRSV成为我国流行的主要毒株。

Guo等发现我国流行的PRRSV美洲型分为4个谱系，分别是以类NADC30为代表的谱系1，以GM2/QYYZ为代表的谱系3，以BJ-4/VR2332为代表的谱系5（亚系5.1）和以CH-1a like/JXA1-like为代表的谱系8（亚系8.1/亚系8.7）。在2013——2018年对山东省及周边地区猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传进化分析研究中共分离出20份毒株，其中13株为高致病性变异毒株，属于亚系8.7；1株与CH-1a处于同一分支，属于亚系8.1，6株与VR2332位于同一分支，属于亚系5.1。本研究分析，该场毒株与经典毒株R98的同源性最高为99.5%，属于亚系5.1，其次为同一谱系的参考毒株VR2332，同源性为99.0%。另外，与经典PVVSV疫苗毒株CH1-R的同源性为90.5%，与变异毒株GD2008、HUN4、JXA1-P80、TJ-M、GD-ZQ-2014的同源性为87%～87.5%，与JL580、NADC30的同源性分别为86%、86.3%，与重组毒株GM2的同源性最低为82.5%。

接种PRRSV疫苗能够产生保护性免疫反应，减轻临床症状和减少病毒排泄量。但本研究发现，该场母猪群血清抗体阳性率为87.05%，离散度偏高为44.21%，抗体整齐度较差，尤其妊娠母猪离散度达到50%以上。这可能与该场使用的疫苗毒株同源性不高，疫苗难以做到有效保护有关。Chung等研究发现，仔猪、断奶猪感染PRRSV与母源抗体的减少有关。本研究检测结果显示，仔猪和断奶猪血清抗体阳性率为仅为57.80%，这可能是由于仔猪、断奶猪受到持续感染、母源抗体保护的时间减少，导致对仔猪的保护下降。

根据张东成等对发病猪群的3次（前驱期、明显期、转归期）ELISA抗体水平检测，发现可以根据S/P值来判定感染猪群是活跃猪群，还是稳定猪群（转归期及以后）。该场育肥猪血清抗体阳性率为96%，而S/P值在2.0以上，可以推测该场育肥猪群为感染PRRSV的活跃猪群。当育肥活跃猪群感染PRRSV后，仔猪和保育猪免疫保护水平不足，开始感染，继而出现呼吸困难、咳嗽、厌食、被毛粗乱、共济失调等症状，母猪群出现不同程度的流产、产死胎等繁殖障碍疾病。

本研究揭示了该场流行的毒株与R98同源性最高，与VR2332处于同一分支，属于亚系5.1，与疫苗毒株CH1-R同源性偏低，猪群抗体水平偏低，保护力不足，需要通过选择同源性高的疫苗毒株，并加强生物安全控制进行系统性防控。