基于Wnt通路的补肾养血法联合DKK1-Ab治疗对缺血型骨不连大鼠骨形成的影响

陈潮锋 李 悦 直彦亮 姜自伟 石宇雄 梁锦成 刘 锋 何德利

（1 广州市番禺区中医院（广州中医药大学番禺中医院），广东 广州 511400；2 广州中医药大学，广东 广州 510405；3 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

骨不连是创伤性骨折严重的并发症之一，其治疗仍是困扰广大外科医师和骨科医师的难题。高龄与伴有多种基础疾病为骨折和内固定术后骨折愈合带来了巨大的挑战[1]。在所有的骨折患者中愈合障碍的发生率为5%～10%[2]。其中有2%～5%的患者其骨折会在愈合过程中出现中止，进而引起骨折延迟愈合，甚至骨不连[3]。Wnt信号通路是与骨代谢关系密切的一个重要信号通路，与骨形成相关。DKK1（Dickkopf-1）是一种分泌型的糖蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路传导的抑制因子[4]。DKK1中和抗体（DKK1-Ab），能有效拮抗DKK1在Wnt/β-catenin信号通路的抑制效应，促进骨形成，加快骨折的愈合速度[5]。既往研究表明，补肾养血方含药血清可显著促进沉默DKK1干预后细胞增殖和提高ALP活性，上调结缔组织生长因子、骨保护素、骨桥蛋白的表达[6]。现代药理学研究指出，补肾养血法可加快局部微循环修复，改善骨折端血液供应，增强炎性细胞的吞噬功能[7]。但补肾养血方联合DKK1-Ab治疗的效果如何还未见报道。基于此，本研究旨在探究基于Wnt通路的补肾养血法联合DKK1-Ab治疗对缺血型骨不连大鼠骨形成的治疗效果和作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料 SPF级雌性SD大鼠48只，体质量180～220 g，鼠龄10～12周，由广州中医药大学动物实验中心提供[合格证SCXK（粤）2013-0034]。实验动物分笼饲养，每笼最多5只。饲养室温24～28 ℃，相对湿度为55%～65%，自由摄食水，每日照明12 h，黑暗12 h。

1.2 补肾养血方配制及DKK1-Ab干预 补肾养血中药独活寄生汤（独活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、肉桂、细辛、秦艽、茯苓、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药、干地黄各6 g），水煎、过滤、浓缩为2 g/mL的生药，灌胃前使用蒸馏水配制成20 mg/mL的浓度，每日1次灌胃。DKK1-Ab以25 mg/kg在骨折部位附近皮下注射，每周2次。

1.3 实验试剂 生理盐水、补肾养血中药购于广州中医药大学第一附属医院；DKK1-Ab购于美国Abcom公司（批号ab196558）；戊巴比妥（批号20170325）购自国药集团化学试剂有限公司；12 cm手术用剪、10 cm眼用有齿镊购自上海金钟医疗手术器械厂；其余试剂均购于广州菲博生物科技公司。

1.4 实验动物分组与造模 将48只SD大鼠随机分为4组：骨不连对照组、DKK1-Ab治疗组、补肾养血中药治疗组及联合治疗组。分组后进行造模，具体造模方法：第1步克氏针固定，行腹腔麻醉（5%水合氯醛，5 mL/kg），常规消毒铺巾，取左下肢髌骨内侧切口，纵行切开皮肤3 cm，将髌骨往外侧牵拉使之脱位，显露股骨髁间凹。用20号注射针自股骨髁间凹插入髓腔扩髓，然后取出注射针，逆行插入克氏针（直径0.2 mm），从大转子及皮肤穿出，克氏针远端埋于股骨髁间骨皮质下，近端紧贴大转子将尾部折弯剪除多余部分，随后逐层闭合切口。第2步以改良Thamos法模拟高能量暴力所造成的股骨干闭合骨折，将动物右下肢外展内旋位固定于骨折造模装置的铁砧凹槽上（铁砧凹槽间距为15 mm），造模支架柱下端骨刀压于大腿中部，由助手提起500 g的砝码至35 cm处，让其自由落体撞击股骨，致股骨中段骨折。期间允许自由负重、活动，分笼标准饲料喂养。第3步对大鼠右侧股动脉进行结扎，术前使用Doppler血流仪测量双下肢血流灌注情况，在股骨干造模后，取侧卧位，常规剃毛备皮，用75%乙醇消毒左下肢皮肤，常规消毒铺巾。用眼科镊夹起皮肤，用手术刀从左侧腹股沟至大腿内侧作一1.0～1.5 cm的切口，在手术显微镜下依次分离各层组织，于血管鞘内充分分离股动脉、股静脉和股神经，仔细游离股动脉，注意保护动脉，用2根8号可吸收线在股动脉远近端分别结扎，上端紧靠股动脉分支，下端距上端约5 mm（图1）。用眼科剪将两结扎点间的股动脉剪断，随后缝合皮肤[8]。期间允许自由活动，术后3 d常规予以青霉素抗感染。造模成功后按分组每日进行药物灌胃，持续灌胃7 d，DKK1-Ab皮下注射2次。

1.5 HE染色检测成骨细胞数、破骨细胞数及血管数 分别于干预后第14、28日分次处死各组小鼠。取骨折周围1 cm的骨段（均分3份），将一部分置于40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，后将其置于10%的EDTA-2Na溶液脱钙（每2～3 d更换1次脱钙液）。待骨质松软，针刺刀割无明显阻力后表示脱钙完成。以骨段纵轴为中心剖开骨段，经系列乙醇脱水、透明、浸蜡、剖面向下，低熔点石蜡包埋。用全自动切片机切成厚度约5 µm的蜡片，将蜡片分别展于载玻片上，做好标记，置于干燥箱中，42 ℃烤片48 h。石蜡切片经2次二甲苯脱蜡，梯度乙醇下行至水略洗，Harris苏木精溶液染色15 min后水洗，蓝化入1%伊红水溶液1 min，用体积分数为95%的乙醇分色并上行至无水乙醇、二甲苯后，用中性树胶封固。切片制作完成后用200倍光学显微镜观察成骨细胞数、破骨细胞数及血管数。

1.6 免疫组化检测VEGF、BMP-2含量 采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测VEGF、BMP-2含量，根据VEGF、BMP-2ELISA试剂盒说明书进行操作，石蜡包埋切片，常规脱蜡到水化后，滴加一抗，放置在4 ℃条件下12 h PBS冲洗3次，每次2 min；滴加二抗，在37 ℃条件下孵育30 min PBS冲洗3次每次2 min；使用DAB显色试剂显色。在400倍光学显微镜下检测阳性信号灰度，采用BI-2000医学图像分析系统分析数据。

1.7 β-catenin 蛋白质印迹分析 如前述分4次，各组取1份（约250 mg）骨痂组织，加1 mL含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂，匀浆后抽提总蛋白。取出细胞，PBS洗涤2次，加入适量预冷的细胞裂解液，刮下细胞，将样品转移入Ep管中，冰上裂解细胞10～15 min，用超声破碎仪破碎细胞，4 ℃高速离心15 min，取上清液。调整蛋白终浓度均为2 μg/μL，加入相同体积的缓冲液，混匀，沸水浴煮5 min，10%SDS-PAGE后转膜，封闭。加入一抗（兔抗人p120ctn 抗体1∶1000，鼠抗人GAPDH 抗体1∶5000，鼠抗Flag 抗体1∶5000），4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应的二抗孵育PVDF膜2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL发光剂，显影、定影，分析β-catenin 含量

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析。计量资料采用（）表示，组间比较行t检验；计数资料采用[n（%）]表示，组间差异采用ANOVA方差分析；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨组织学检查 干预14 d后，除骨不连对照组外，各组骨折损伤区的成骨细胞和血管数增多，与补肾养血中药治疗组比较，DKK1-Ab治疗组、联合治疗组成骨细胞数量均显著升高（P＜0.05）；而补肾养血中药治疗组的血管数较DKK1-Ab治疗组显著升高（P＜0.05）。干预28 d后，与骨不连对照组比较，各组成骨细胞和血管数含量持续显著升高（P＜0.05）；联合治疗组的血管数与补肾养血中药治疗组和DKK1-Ab治疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，补肾养血中药治疗组较DKK1-Ab治疗组的血管数显著升高（P＜0.05）。见表1，图1、2。

图1 组织学切片，箭头所指为成骨细胞

表1 4组大鼠的组织学指标变化情况（）

表1 4组大鼠的组织学指标变化情况（）

注：与骨不连对照组同期比较aP＜0.05；与DKK1-Ab治疗组同期比较bP＜0.05；与补肾养血中药治疗组同期比较cP＜0.05。

2.2 补肾养血法对血清VEGF、BMP-2水平的影响 干预14 d后，与骨不连对照组比较，其余各组BMP-2、VEGF蛋白表达量均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；补肾养血中药治疗组较DKK1-Ab治疗组显著升高（P＜0.05），而联合治疗组VEGF表达量与DKK1-Ab治疗组、补肾养血中药治疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预28 d后，与骨不连对照组比较，其余各组BMP-2、VEGF蛋白表达量均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；联合治疗组的BMP-2表达量与DKK1-Ab治疗组、补肾养血中药治疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图2 组织学切片，箭头所指为血管

表2 4组大鼠的生长因子变化情况（）

表2 4组大鼠的生长因子变化情况（）

注：与骨不连对照组同期比较aP＜0.05；与DKK1-Ab治疗组同期比较bP＜0.05；与补肾养血中药治疗组同期比较cP＜0.05。

2.3 补肾养血法对骨组织中β-catenin蛋白水平的影响 干预14 d后，与骨不连对照组相比，各组β-catenin蛋白表达相对较多，差异有统计学意义（P＜0.05），且联合治疗组较DKK1-Ab治疗组、补肾养血中药治疗组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预28 d后，DKK1-Ab治疗组、补肾养血中药治疗组、联合治疗组β-catenin蛋白表达量与骨不连对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合治疗组的β-catenin蛋白表达量与DKK1-Ab治疗组、补肾养血中药治疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4组大鼠的β-catenin蛋白变化情况（）

表3 4组大鼠的β-catenin蛋白变化情况（）

注：与骨不连对照组同期比较aP＜0.05；与DKK1-Ab治疗组同期比较bP＜0.05；与补肾养血中药治疗组同期比较cP＜0.05。

3 讨 论

在临床上，缺少血液供应支持是导致骨折延迟愈合或骨不连的一个重要因素。在本实验中，通过结扎大鼠的股动脉，对股骨中段使用三点冲击法进行造模，而通过既往的预实验，已经明确了该造模法接近临床，通过这种造模方法可造成急性缺血的微环境而不损伤软组织，可有效避免由于骨膜组织和骨髓的过度损伤而带来的影响。骨不连在祖国医学中归属到“骨虚”、“骨萎”范畴，系邪盛正衰、肾精耗伤，气血两虚不能运行而气滞、血瘀所致，“虚”、“瘀”并存，本虚标实，故标本同治，才能相得益彰。肝肾两脏，皆为要本，不可偏废，肝主筋，主藏血，筋束骨，筋骨相连。由此从理论上确立了调补肝肾是促进骨折愈合的重要环节。陈士铎言“骨伤必内动于肾，筋伤必内动于肝，肾不生髓则不能养骨，血不濡筋，则筋松而不能束骨”。独活寄生汤出自唐•孙思遂《备急千金要方》。专为痹证日久，肝肾两亏，气血不足而设。症见腰膝疼痛，肢节屈伸不利，或麻木不仁，畏寒喜温，心悸气短，舌淡苔白，脉象细弱等。功能补气血，益肝肾，祛风湿，舒筋骨，止痹痛。独活寄生汤作为中医的经典方剂，已被广泛用于膝关节炎、腰痛等骨科疾病的临床治疗中。方中党参、茯苓、甘草补气健脾，建运化生之源。正旺则邪自除，当归、川芎、地黄、白芍养血又兼活血，即所谓治风先活血，血行风自灭牛膝、杜仲、寄生祛风湿、补肝肾、强筋壮骨，独活祛风、善祛下焦与筋骨间之风寒湿邪，防风祛风邪以胜湿，秦艽除风湿而舒筋，且又风能胜湿，风去湿自除，佐以细辛发散阴经风寒，搜剔筋骨风湿以镇痛。综合全方，祛邪扶正，标本兼顾，可使血气足而风湿除，肝肾强而痹痛愈。本研究中联合治疗组骨愈合效果明显优于其他3组，说明独活寄生汤对于骨的生长以及血管生成具有促进的作用[9]。补肾养血法干预后血管数与VEGF水平较DDK1-Ab治疗有统计学意义，说明补肾养血法通过改善骨不连模型的缺血状况来改善局部的营养状况及促进局部生长因子的聚集，继而促进骨的愈合[10]。与既往通过促进骨愈合改善骨不连的报道不同，本研究揭示了血管在骨不连的作用以及补肾养血法治疗骨折不愈合的潜在机制。

骨不连是骨科临床上面临的诸多重要难题之一，目前西医常采用手术治疗，如自体骨移植或干细胞移植等方法，又或通过冲击波、电刺激局部改善局部微循环[11]。其手术效果一般，主要是无法使纤维、软骨组织转变为骨组织。多数骨不连患者都存在受伤时间较长、气血双亏、肝肾不足，故而对筋骨、肌肉的生成产生阻碍[12]。局部损伤后血液阻滞血流不畅，久伤引起气滞血瘀、经络不通，筋骨长期得不到滋养，最终都会影响骨折的愈合。本实验通过制备缺血型骨不连模型，配合补肾养血法干预，结果发现补肾养血法可改善骨不连，而潜在机制可能是改善局部的血供[13]。

综上所述，过表达DKK1可改善骨不连愈合效果。补肾养血法可改善实验大鼠的骨不连情况，其机制可能与改善局部血液供应相关，但其起主要作用的成分以及治疗骨质疏松的其他机制还有待进一步研究。