基于Nrf2通道研究柚皮素磷脂复合物对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用

吉 洁，于海涛，周春刚，唐 颖，唐苗苗，周倩倩，徐新荣

0引言

流行病学调查显示，氧化应激与干性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)密切相关。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)体系和视网膜光感受器是人体平均耗氧最多的环境之一，对氧化应激非常敏感。干性ARMD中，脂褐质及其他代谢产物堆积在RPE与脉络膜之间，补体系统及炎症反应被激活，氧化应激反应加速，破坏了正常视网膜内的抗氧化修复系统。RPE因氧化损伤造成活性氧化产物生成增多是干性ARMD发生发展的重要原因[1]。

核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一种重要的氧化还原转录因子，敏感性强，细胞内Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶通过其诱导调控表达，使机体的氧化应激状态得到改善，稳定细胞的氧化还原状态，促进细胞存活。当细胞受到活性氧或亲电体的攻击时，Nrf2从Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like ECH associated protein-1，Keap1)中解离，迅速进入细胞核与小Maf蛋白结合形成异二聚体，再结合抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)，转录激活受Nrf2调控的抗氧化酶[醌氧化还原酶-1(quinone oxidoreductase-1，NQO-1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)]基因表达[2]。Nrf2/ARE是人体最为重要的抗氧化应激防御性转导通路[3]。

柚皮素(naringenin，Nar)是一种二氢黄酮类单体化合物，取自芸香科植物柚，具有抗氧化、抗炎、抗癌、解痉和利胆作用，能够清除活性氧自由基从而减轻氧化应激反应[4]。为了提高柚皮素的生物利用度，本研究参考文献制备了柚皮素磷脂复合物(naringin phospholipid complex，NPC)，观察其对氧化损伤ARPE-19细胞内氧化指标、抗氧化指标含量的影响和对Nrf2/ARE抗氧化应激通路中Nrf2及其下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶表达的影响，实验过程及结果报告如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验细胞人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)购自美国模式培养物研究所(ATCC公司)。

1.1.2主要实验试剂和仪器细胞总RNA快速提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；逆转录试剂盒(赛默飞世尔公司)；PCR检测试剂盒(天根生化科技有限公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、ECL Plus发光试剂盒、Western blot及PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、IP细胞裂解液(碧云天公司)；Nrf2、GCL、NQO-1、HO-1抗体(Abcam，ab62352、ab124827、ab28947、ab13243)。微量加样器(德国Eppendorf公司)；OD值测量仪(高精度分光光度计)(Merinton，SMA4000)；荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems，ABI StepOne Plus)；台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪器厂，H1650R)；酶标仪SPECTRA max Plus 384(Molecular Devices公司)；凝胶成像仪、电泳系统(Bio-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1 NPC制备参考文献[5]中根据单因素试验确定的磷脂复合物最佳制作工艺制备NPC。将质量比为1∶2的柚皮素和大豆磷脂溶解于适量乙酸乙酯中，柚皮素质量浓度为5g/L。反应温度40℃，恒温搅拌2h。反应结束减压后除去乙酸乙酯。洗涤真空干燥12h即得到NPC。研磨后过100目筛，放置在干燥器中备用。

1.2.2细胞转染按照Lipofectamine 2000 Reagent试剂说明书进行细胞转染。将对数期生长的APRE-19细胞在转染前1d以每孔3×105个细胞接种入6孔板中，放置在完全培养基(10%胎牛血清-RPMI DMEM)中，在5% CO2饱和度培养箱，恒温37℃过夜培养20～24h。吸去完全培养基，在37℃下预热PBS和无血清RPMI 1640培养基，分别用之洗涤细胞。145μL Opti-MEM培养基中加入5μL转染试剂(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)，将枪头混合均匀，标为混合物1。150μL Opti-MEM培养基中放入Nrf2-siRNA(GUUUUUCCAGCUCATACUCTT)7.8μL，轻轻稀释混匀，标为混合物2。混合物1中加入混合物2，保持室温，静置20min使形成DNA-脂质体复合物。用Opti-MEM培养基洗涤细胞1次，无血清和抗生素的RPMI DMEM培养基1.7mL加入到每孔中，300μL上述混合物再逐滴加入，轻轻混匀后5% CO2饱和度培养箱37℃培养48h。

1.2.3模型制备及细胞分组在无菌培养瓶中接种ARPE-19细胞，加入适量DMEM培养液后，置于37℃含5% CO2的培养箱内培养。收集对数期细胞，每孔加入200μL培养基。铺板使细胞密度为4 000个/孔，边缘用无菌PBS填充，培养箱内孵育，至细胞单层铺满孔底。将ARPE-19细胞分为溶媒组、模型组、Nrf2-siRNA组、柚皮素组、NPC组、Nrf2-siRNA+柚皮素组、Nrf2-siRNA+NPC组。溶媒组：用二甲基亚砜(DMSO)培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物溶解；模型组：加入200μmol/L叔丁基氢过氧化物(t-BHP)培养基，培养箱内孵育24h；Nrf2-siRNA组：针对Nrf2基因进行细胞转染；柚皮素组：加入200μmol/L柚皮素培养基预处理24h后再加入200μmol/L t-BHP培养基孵育24h；NPC组：加入200μmol/L NPC培养基预处理24h后再加入200μmol/L t-BHP培养基孵育24h；Nrf2-siRNA+柚皮素组：APRE-19细胞加入200μmol/L柚皮素培养基预处理24h，Nrf2基因干扰6h后再加入200μmol/L t-BHP培养基孵育24h；Nrf2-siRNA+NPC组：APRE-19细胞加入200μmol/L NPC培养基预处理24h，Nrf2基因干扰6h后再加入200μmol/L t-BHP培养基孵育24h。

1.2.4观察指标

1.2.4.1细胞内氧化应激水平测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平检测：取适量10nmol/mg标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μmol/L，加入0.1mL上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1mL各组APRE-19细胞用于测定；随后加入0.2mL MDA检测工作液，混匀后，100℃加热15min。水浴冷却至室温，1 000g室温离心10min。取200μL上清液加入到96孔板中，用酶标仪测定波长532nm的吸光度。活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平检测：装载DCFH-DA探针于培养基中，工作浓度为10μmol/L，37℃孵育30min。胰酶消化细胞2min，加入培养基终止消化，600g离心5min收集各组ARPE-19细胞，用预冷的1×PBS洗2次，离心收集细胞沉淀物，将离心好的细胞用PBS重悬，用酶标仪检测525nm波长的吸光度。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)水平检测：胰酶消化各组ARPE-19细胞2min，加入培养基终止消化，600g离心5min收集细胞，加入显色剂混匀，室温反应10min，SOD酶标仪测550nm波长的吸光度，T-AOC酶标仪测520nm波长的吸光度。分别计算MDA、ROS、SOD、T-AOC水平。

1.2.4.2 RT-PCR检测胰酶消化终止后收集各组细胞，裂解。用氯仿、Trizol、无水乙醇等试剂离心柱法提取总RNA，计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量。参照逆转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，根据RNA OD值报告的浓度值计算ddH2O量，稀释RT产物到一致水平，进行PCR扩增。引物序列见表1。内参基因为β-actin，按照2-ΔΔCt法对mRNA的表达进行相对定量分析。

表1 引物序列

1.2.4.3 Western blot检测上述细胞用PBS洗涤，收集裂解后，于4℃下12 000r/min离心10min，转移上清到新的离心管中，-70℃保存。BCA法测定蛋白浓度。10%分离胶，5%浓缩胶，加入5×上样缓冲液混匀，上样量为每泳道30μg，电泳。转膜、封闭。转移PVDF膜到含有一抗(1∶1 000)的小袋中，保持4℃孵育过夜后再转移到含二抗(1∶5 000)的玻璃平皿中，室温下孵育2h。内参为β-actin。PVDF膜表面加ECL试剂，以化学光敏模式在凝胶成像分析仪中曝光显影。

2结果

2.1柚皮素及其磷脂复合物对细胞内氧化应激水平的影响柚皮素、NPC对细胞内MDA、ROS、SOD、T-AOC水平的影响检测结果见表2。模型组较溶媒组细胞内MDA、ROS水平均明显提高，SOD、T-AOC水平均明显降低。NPC组较柚皮素组、Nrf2-siRNA+NPC组较Nrf2-siRNA+柚皮素组细胞内MDA、ROS水平均明显降低，SOD、T-AOC水平均明显提高。

表2 柚皮素及其磷脂复合物对细胞内氧化应激水平的影响 (n=5，nmol/mg)

2.2柚皮素及其磷脂复合物对细胞内Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA表达的影响柚皮素、NPC对细胞内Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA表达的影响检测结果见图1。各组细胞内Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA相对表达量差异均有统计学意义(F=871723.636、178297.326、211246.177、279859.963，均P<0.01)。与溶媒组相比，其余6组细胞内4种基因相对表达量差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，柚皮素组和NPC组细胞内4种基因表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)；与柚皮素组相比，NPC组细胞内4种基因相对表达量差异均有统计学意义(P<0.01)；与Nrf2-siRNA组相比，Nrf2-siRNA+柚皮素组和Nrf2-siRNA+NPC组细胞内4种基因相对表达量差异均有统计学意义(P<0.01)；与Nrf2-siRNA+柚皮素组相比，Nrf2-siRNA+NPC组细胞内4种基因相对表达量差异均有统计学意义(P<0.01)。

图1 柚皮素及其磷脂复合物对细胞内Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA表达的影响 A:Nrf2; B:HO-1; C:NQO-1; D:GCL。bP<0.01 vs 溶媒组；dP<0.01 vs 模型组；fP<0.01 vs 柚皮素组；hP<0.01 vs Nrf2-siRNA组；jP<0.01 vs Nrf2-siRNA+柚皮素组。

2.3柚皮素及其磷脂复合物对细胞内Nrf2、NQO-1、HO-1、GCL蛋白表达的影响柚皮素、NPC对细胞内Nrf2、NQO-1、HO-1、GCL蛋白表达的影响检测结果见图2、3。各组细胞内Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达量差异均有统计学意义(F=64.852、123.594、26.617、51.759，均P<0.01)。与溶媒组相比，其余6组细胞内4种蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，柚皮素组和NPC组细胞内4种蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)；与柚皮素组相比，NPC组细胞内4种蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)；与Nrf2-siRNA组相比，Nrf2-siRNA+NPC组细胞内4种蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)；与Nrf2-siRNA组相比，Nrf2-siRNA+柚皮素组细胞内GCL蛋白表达水平差异有统计学意义(P=0.004)，其余3种蛋白表达差异无统计学意义(PNrf2=0.069，PHO-1=0.174，PNQO-1=0.817)；与Nrf2-siRNA+柚皮素组相比，Nrf2-siRNA+NPC组细胞内4种蛋白表达水平差异均有统计学意义(PNrf2=0.009，PHO-1<0.01，PGCL<0.01，PNQO-1=0.021)。

图2 Western blot检测Nrf2、NQO-1、HO-1、GCL蛋白表达。

3讨论

目前对于干性ARMD尚无有效的治疗方法，其发病机制尚不明确，但已有研究表明，氧化应激损伤是干性ARMD发生发展的重要原因。Abokyi等[6]认为视网膜氧化损伤在ARMD形成途径中起中心作用。孙子雯等[7]就氧化应激介导ARMD的发生机制及ARMD抗氧化剂的应用作过简要综述。临床和基础研究通过使用维生素、多不饱和脂肪酸和其他植物提取的抗氧化物进行治疗，对抑制干性ARMD的晚期发展有明显效果。年龄相关性眼病研究组(Age-Related Eye Disease Study，AREDS)证实，抗氧化剂的使用可以降低25%晚期ARMD在5a内进展的风险，降低19%中度视力下降的风险[8]。

Nrf2抗氧化应激通路在ARMD的发病过程中具有重要作用，Zhao等[9]研究显示，Nrf2缺陷小鼠视网膜出现了ARMD样改变。既往研究证实，激活Nrf2通路对氧化损伤的RPE细胞具有保护作用[10-11]。 陈婷妍等[12]研究发现槲皮素可能通过Nrf2/Keap1/ARE通路改善视网膜光损伤后的氧化应激状态，保护视网膜功能，对ARMD具有保护作用。

图3 柚皮素及其磷脂复合物对细胞Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达的影响 A:Nrf2; B:HO-1; C:NQO-1; D:GCL。aP<0.05 vs 溶媒组；dP<0.01 vs 模型组；fP<0.01 vs 柚皮素组；gP<0.05 vs Nrf2-siRNA组；iP<0.05，jP<0.05 vs Nrf2-siRNA+柚皮素组。

柚皮素具有抗氧化作用，但柚皮素难溶于水，生物利用度低，其磷脂复合物能明显改善原药的理化性质，增强药理作用。杨艳等[13]研究显示磷脂复合物中磷脂可显著提高槲皮素在水中的溶解度，约为原药的3倍，磷脂复合物和物理混合物均可显著提高槲皮素在氯仿中的溶解度，前者作用更明显。

ROS是需氧细胞在代谢过程中产生，可以氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸，最终的反应产物是MDA。脂质过氧化过程中重要的反应产物之一是MDA，可通过测定MDA的含量了解脂质过氧化的程度。ROS和MDA是两种有代表性的氧化指标。SOD是机体内一种重要的抗氧化酶，是重要的ROS清除剂，体内的超氧阴离子、氧自由基及脂质过氧化物可以被消除。SOD可以防止和减轻机体组分在分子水平、细胞水平受到过氧化损伤。T-AOC是反映机体整体抗氧化水平高低的重要指标。SOD和T-AOC是两种具有代表性的抗氧化指标。本研究中模型组与溶媒组比较，细胞内MDA、ROS含量明显增加，SOD、T-AOC水平明显降低，NPC较柚皮素能明显降低ARPE-19细胞内MDA、ROS的含量，明显提高细胞内SOD、T-AOC水平。

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可以通过多种不同转染技术导入细胞内，以单链形式与外源基因表达的mRNA相结合，并诱导相应mRNA降解，敲弱特定基因的功效。经过适当剪裁的siRNA，可以利用它的互补性来标定已知序列的基因，所以在基因功能与药物目标的研究中siRNA成为了一项重要工具。本研究运用siRNA干扰技术抑制ARPE-19细胞Nrf2基因表达，观察柚皮素及其磷脂复合物对Nrf2/ARE抗氧化应激通路的作用。杨艳等[13]在研究槲皮素磷脂复合物对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用的研究中发现，槲皮素磷脂复合物能显著提高原药的生物活性，对氧化损伤ARPE-19细胞比槲皮素起到更好的保护作用。本研究结果显示，ARPE-19细胞受到t-BHP氧化应激损伤后，Nrf2由细胞质进入细胞核，与ARE结合，启动抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶靶基因的转录激活，Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL转录均升高，Nrf2-siRNA组较t-BHP模型组均下降；柚皮素和NPC预保护ARPE-19细胞后，4种基因表达水平较模型组和Nrf2-siRNA组均升高；Nrf2-siRNA+柚皮素组较Nrf2-siRNA组Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达无显著差异；Nrf2-siRNA+NPC组较Nrf2-siRNA组4种蛋白表达差异均有统计学意义，NPC作用明显强于柚皮素。

综上所述，NPC增强了原药的药理作用，提高了柚皮素的生物利用度，其通过激活Nrf2/ARE抗氧化应激通路上调Nrf2及其下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达，对氧化损伤ARPE-19细胞起到更好的保护作用。