国标方法检测特殊医学用途婴儿配方食品中部分B族维生素的基质适用性

郭美娟，史国华，张 斌，李杨薇宇，张 岩*，张兰天*

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050200）

我国每年新出生婴儿有上千万，其中一部分婴儿由于各种疾病的影响，母乳或普通婴儿配方奶粉不能满足其营养需要。特殊医学用途配方食品是这些婴儿生命早期或相当长时间内赖以生存的主要食物来源，所以特殊医学用途婴儿配方食品的安全性、营养成分分析以及适用性等问题应给予更多重视。常见的特殊医学用途婴儿配方食品包括无乳糖配方或低乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早产/低出生体重婴儿配方、婴儿营养补充剂、氨基酸代谢障碍配方。每种特殊医学用途婴儿配方食品均有其自身的产品特点。本实验选取在特殊医学用途婴儿配方食品较常见且比较有代表性的3 种配方。乳蛋白部分水解配方食品的主要技术要求此类食品是将牛奶蛋白经过加热和（或）酶水解为小分子乳蛋白、肽段和氨基酸，以降低大分子牛奶蛋白的致敏性。乳蛋白深度水解配方的主要技术要求应用一定工艺手段将过敏原去除或不含过敏原，适用于牛奶蛋白过敏的婴儿，另还需要根据婴儿的代谢情况调整部分维生素和矿物质。氨基酸配方的主要技术要求以氨基酸为主要原料，但不含或仅含少量与代谢障碍有关的氨基酸，满足患者的部分蛋白质（氨基酸）需求。GB 10765—2010《婴儿配方食品》中将婴儿配方食品分为乳基婴儿配方食品和豆基婴儿配方食品。乳基婴儿配方食品是指以乳类及乳蛋白制品为主要原料，加入适量的维生素、矿物质和/或其他成分，仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品。豆基婴儿配方食品是指以大豆及大豆蛋白制品为主要原料得到的产品。因其以植物蛋白为主要原料，对乳糖不耐受、牛奶蛋白过敏、易腹泻的敏感婴儿更为适用。因此豆基配方在特殊医学用途配方食品中更为常见。可见，无论从配方还是基质看，特殊医学用途婴儿配方食品是一类既特殊又复杂的食品。

特殊医学用途婴儿配方食品含有多种维生素和矿物质等婴儿生长不可缺少的营养成分。其中B族维生素是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的水溶性维生素，可以帮助维持心脏、神经系统功能，维持消化系统及皮肤的健康，缺乏B族维生素，会导致代谢障碍，人体易出现怠滞和血压升高等问题[1-5]。在婴幼儿配方奶粉中常添加一定量的B族维生素，以保证婴幼儿摄取的需要。但添加量必须控制在一定范围，以免产生不良影响。因此检测婴幼儿配方奶粉以及特殊医学用途婴儿配方食品中的B族维生素含量有着重要的现实意义。常见的B族维生素有硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酸/烟酰胺（VB3）、泛酸（VB5）、吡哆醇/吡哆醛/吡哆胺（VB6）、生物素（VB7）、叶酸（VB9）、钴胺素（VB12）等。GB 25596—2010《特殊医学用途婴儿配方食品通则》中规定了在特殊医学用途婴儿配方食品中VB1、VB2、VB6、VB12、烟酸、泛酸、叶酸、生物素这8 种B族维生素的限量范围[6]。

目前国内外关于检测B族维生素的研究较多，文献报道的检测方法有毛细管电泳法[7]、酶联免疫法[8]、电化学发光法[9]、液相荧光测定法[10]、液相色谱法[11-17]、液相色谱-串联质谱法[18-21]、离子色谱法[22]、电感耦合等离子体质谱法[23-24]等，各个方法均存在一定的优缺点，且大多数方法主要针对部分基质进行方法的开发和应用。

我国有一系列食品安全国家标准可用于对食品包括婴幼儿配方奶粉中B族维生素的检测[25-28]，若检测方法不适用于特殊医学用途婴儿配方食品，不利于特殊医学用途婴儿配方食品的研发，同样不利于监管部门的监督。特殊医学用途婴儿配方食品作为特殊食品，其基质与普通食品区别较大，但国标方法中并没有专门针对特殊医学用途婴儿配方食品的检测方法，国标方法在特殊医学用途婴儿配方食品中的适用性有待研究。本研究联合7 家实验室按国标方法分别对3 类不同配方的8 种特殊医学用途配方奶粉中的VB1、VB2、VB6和烟酸进行测定，分析国标方法在特殊医学用途婴儿配方食品中的适用性，旨在推动我国特殊医学用途婴儿配方食品中成分检测方法的完善。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

选用特殊医学用途婴儿配方食品共3 类配方，8 种产品。分别为乳蛋白部分水解配方奶粉4 种，乳蛋白深度水解配方奶粉2 种，氨基酸配方奶粉2 种，样品编号及配方信息见表1。

表1 样品信息Table 1Information about samples selected in this study

仪器、试剂及标准溶液配制分别参照GB 5009.84—2016《食品中维生素B1的测定》第一法 高效液相色谱法、GB 5009.85—2016《食品中维生素B2的测定》第一法 高效液相色谱法、GB 5009.89—2016《食品中维生素烟酸的测定》第二法 高效液相色谱法、GB 5009.154—2016《食品中维生素B6的测定》第一法 高效液相色谱法中要求进行[25-28]。

1.2 方法

VB1的样品前处理以及检测分析：采用GB 5009.84—2016第一法 高效液相色谱法[25]；VB2的样品前处理以及检测分析：采用GB 5009.85—2016第一法 高效液相色谱法[26]；烟酸的样品前处理以及检测分析：采用GB 5009.89—2016第二法 高效液相色谱法[27]；VB6的样品前处理以及检测分析：采用GB 5009.154—2016第一法 高效液相色谱法[28]。

2 结果与分析

2.1 婴儿配方奶粉参考样品结果

目前因无法得到特殊医学用途产品的参考样品，代以婴儿配方奶粉参考样品作为参考，参考值由具有ISO 17043资质的实验室基于EN 14122、EN 14152、EN 14164、EN 15652的内部检测方法依据能力验证统计方法计算得出。本研究参加比对的7 家实验室分别使用GB 5009.84—2016第一法、GB 5009.85—2016第一法、GB 5009.154—2016第一法、GB 5009.89—2016第二法对VB1、B2、B6和烟酸进行检测，检测参考样品结果，如表2、3所示。

表2 婴儿配方奶粉参考样品含量检测结果Table 2Results for the determination of B vitamins in reference samples of infant formula milk powder

表3 婴儿配方奶粉参考样品Z值检测结果Table 3Results obtained for the determination of B vitamins in reference samples of infant formula milk powder

Z值用于衡量某一测试结果在一组数据中相对中位值的偏离程度，Z值绝对值越小，表明该结果的偏离程度越低。Z=（测试结果－中位值）/NIQR，其中NIQR为测试结果的标准四分位数间距。Z值的判定原则：|Z|≤2，为满意结果；2＜|Z|＜3，为可疑或有问题结果；|Z|≥3，为不满意结果。

从以上数据可以看出，除VB1的检测结果普遍偏高以外，其他检测项目数值均与参考值相近，标准偏差比（standard deviation ratio，SDR）非常小，Z值小于2，证明检测结果满意。在VB1的测定中，参考样品的结果使用EN 14122方法测定的，在盐酸硫胺素换算时选用系数1.26，而本研究采用的GB 5009.84—2016选用系数1.12。因此，本研究用各实验室测定的结果普遍比参考样品的参考值高。使用EN 14152与GB 5009.85—2016第一法测定VB2，使用EN 14164与GB 5009.154—2016第一法测定VB6，使用EN 15652的内部方法与GB 5009.89—2016第二法测定烟酸，在婴儿配方产品中检测结果一致。验证了国标方法在婴儿配方奶粉中的适用性以及7 家实验室的检验能力能够满足本研究的要求。

2.2 特殊医学用途婴儿配方食品样品中VB1测定结果

表5 VB1 ZB值实验结果（GB 5009.84—2016第一法）Table 5ZB value for vitamin B1in infant formula foods for special medical purposes determined by method I in the national standard GB 5009.84—2016 in seven laboratories

实验室间测量结果的Z值被定义为ZB值，用来衡量实验室间测试结果的系统误差。如表4、5所示，除实验室3外，其他6 个实验室的检测结果精密度符合检测要求，|ZB|值均不大于2。实验室3有6 个偏高的离群结果，可能是由于选用了不合适的色谱柱，使目标物VB1不能与干扰物完全分离造成的。根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检验》中对于精密度的要求，被测组分含量为1 mg/kg时，实验室内变异系数为11%。从表4可以看出，所有样品的实验室间变异系数处于17.9%～39.2%之间，说明实验室间结果有一定差异性。

表4 VB1实验结果（GB 5009.84—2016第一法）Table 4Results obtained for the determination of vitamin B1 in infant formula foods for special medical purpose by method I in the national standard GB 5009.84—2016

Cm可以根据公差范围和标准偏差得到。一般认为，Cm≥1.67，为满意结果，方法适用能力好；1.33＜Cm＜1.67，为有问题结果，方法能力有待进一步确认；Cm＜1.33，为不满意结果，方法不适用。从表4看出，除深度水解配方的2 个样品外，其余所有样品的方法能力Cm值均小于1.33，认为样品与方法不适配。实验室3几乎所有样品均为偏高的离群结果，剔除该实验室的数据后重新计算，所有实验室的方法能力Cm值均大于设定值1.67，认为样品与方法适配。

2.3 特殊医学用途婴儿配方食品样品中VB2测定结果

表7 VB2 ZB值实验结果（GB 5009.85—2016第一法）Table 7ZB values for vitamin B2in infant formula foods for special medical purposes determined by method I in the national standard GB 5009.85—2016 in seven laboratories

从表6、7可以看出，除实验室5的乳蛋白部分水解配方A和D、实验室6的乳蛋白部分水解配方B和E、实验室1的乳蛋白深度水解配方G的5 个检测|ZB|值大于2，其余所有7 个实验室的51 个检测结果的|ZB|值不大于2，说明检测结果精密度符合实验要求。根据GB/T 27404—2008规定实验室内变异系数为11%，只有乳蛋白部分水解配方A样品的变异系数为11.2%，略高于11%，其他样品的实验室间变异系数均小于11%，说明各实验室间结果没有差异性。所有样品的方法能力Cm值均大于设定值1.67，认为样品与方法适配。

表6 VB2实验结果（GB 5009.85—2016第一法）Table 6Results for the determination of vitamin B2in infant formula foods for special medical purposes by method I in the national standard GB 5009.85—2016

2.4 特殊医学用途婴儿配方食品样品中VB6测定结果

表9 VB6 ZB值实验结果（GB 5009.154—2016第一法）Table 9ZB values for vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes determined by method I in the national standard GB 5009.154—2016 in seven laboratories

如表8、9所示，实验室6 有5 个异常偏高的离群结果，剔除该实验室数据后结果如表10、11所示。

表8 VB6实验结果（GB 5009.154—2016第一法）Table 8Results for the determination of vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes by method I in the national standard GB 5009.154—2016

表10 特殊医学用途婴儿配方食品样品中VB6检测结果分析（剔除离群数据）Table 10Analysis of test results for vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes (excluding outlier data)

剔除实验室6的数据后，从表11可以看出，除实验室1的乳蛋白深度水解配方G、实验室4的乳蛋白部分水解配方F的2 个检测|ZB|值大于2，其余所有6 个实验室的54 个检测结果的|ZB|值不大于2，说明检测结果精密度符合实验要求。根据GB/T 27404—2008规定实验室内变异系数为11%，实验室间结果差异性不大。除2 个乳蛋白部分水解配方样品E、F和1 个氨基酸配方样品H外，其余所有样品的方法能力Cm值均大于1.67，认为样品与方法适配，样品E、F和H与方法不适配。在样品处理过程中发现，C、D、H三个样品的滤液不澄清，对检测结果的影响还需进一步研究。从配方上分析C、D、H三个样品，发现这3 款产品的配方中都添加有经预糊化处理的淀粉，这是其他配方和普通婴儿配方奶粉所不具有的成分。在VB6的前处理过程中，将奶粉溶解后首先用淀粉酶进行酶解，很有可能是经预糊化处理的淀粉经酶解后产生的浑浊导致滤液无法澄清。

表11 特殊医学用途婴儿配方食品样品中VB6检测结果分析（剔除离群数据）Table 11Analysis of test results for vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes (excluding outlier data)

实验室6有5 个偏高的离群结果，此样品吡哆胺附近有杂峰，积分有干扰，通过加标确认目标峰。C、D、E、G样品吡哆胺出峰位置有很大的杂峰，出峰时间与吡哆胺一致，容易被当成吡哆胺积分。在现有色谱柱上进行条件优化后，除氨基酸配方D结果差异仍较大外，其他样品均得到比较合理的结果。

2.5 特殊医学用途婴儿配方食品样品中烟酸测定结果

表13 烟酸ZB值实验结果（GB 5009.89—2016第二法）Table 13ZB values for niacin in infant formula foods for special medical purposes determined by method II in the national standard GB 5009.89—2016 in seven laboratories

如表12、13所示，实验室2有5 个偏高的离群结果，|ZB|值大于2，很可能是选用了不合适的色谱柱，使目标物烟酸不能与干扰物完全分离造成，还需进一步内部调查原因。根据GB/T 27404—2008的要求，被测组分含量为10 mg/kg时，实验室内变异系数为7.5%。所有样品的实验室间变异系数处于10.6%～30.8%之间，实验室间结果有一定差异性。所有样品的方法能力Cm值均小于1.67，认为样品与方法不适配。剔除实验室2的数据后，仍有一半样品的方法能力Cm值小于1.67，认为样品与方法不适配。在样品处理过程中发现，同样也是C、D、H三个样品的滤液不澄清，除了与VB6的分析一样考虑淀粉成分对滤液澄清度的影响，还考虑到可能是基质的问题，导致国标方法的前处理不适用于氨基酸配方和深度水解配方食品。VB1和VB2前处理都是用0.1 mol/L的盐酸溶液溶解，经高温酸水解，调节pH值后用混合酶溶液酶解，取滤液。VB6和烟酸的前处理都是用水溶解后调pH值到1.7酸化再用氢氧化钠溶液调pH值到4.5后进行超声过滤。很多的特殊医学用途婴儿配方食品的主要成分是乳糖、麦芽糊精、葡萄糖浆、玉米糖浆等，与普通的婴儿配方奶粉以生牛乳为主要原料截然不同。说明该前处理方法不适用于特殊医学用途婴儿配方食品。

表12 烟酸实验结果（GB 5009.89—2016第二法）Table 12Results obtained for the determination of niacin in infant formula foods for special medical purposes by method II in the national standard GB 5009.89—2016

2.6 加标回收率结果

分别对3 类不用基质的特殊医学用途婴儿配方食品进行回收率实验，如表14所示。标准物质添加量基本与样品含量一致进行添加，从而验证方法在特殊医学用途产品基质中的正确度。

表14 各实验室加标回收率检测结果Table 14Test results of spiked recovery rates in each laboratory

根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检验》中对回收率的要求，被测组分含量为1～100 mg/kg时，实验室回收率范围在90%～110%之间，被测组分含量在0.1～1 mg/kg时，实验室回收率范围在80%～110%之间。VB1回收率结果：除实验室1、2、7外，其他4 家实验室的回收率均不能达到国标要求的80%～110%。实验室3在3 个样品类型上进行的回收率实验结果比参考范围上限高出30%～80%。实验室4～6的回收率结果整体偏低，实验室7在乳蛋白深度水解配方和部分水解配方的回收率结果偏低，在氨基酸配方结果偏高。VB2回收率结果：实验室2、5、6不能达到国标要求的90%～110%，总体处于可接受范围。最低的实验室5在乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方上分别达到－13%、－14%。VB6回收率结果：实验室2、3、4外回收率偏高，其他实验室的回收率均能达到国标要求的80%～110%，总体处于可接受范围。烟酸回收率结果：除实验室4回收率均低于90%，实验室2有1 个数据偏高，实验室6有1 个数据偏低。其他实验室的所有回收率都符合国标要求的90%～110%。

特殊医学用途婴儿配方食品回收率达不到国标要求的原因可能是由于其基质特殊，特殊医学用途婴儿配方食品基质和普通婴儿配方乳粉基质有着很大区别，普通婴儿配方乳粉中蛋白质来源大多是乳蛋白或大豆蛋白，基质相对简单。特殊医学用途婴儿配方食品中蛋白质等物质来源多样，基质复杂。

3 结 论

特殊医学用途婴儿配方食品中部分水解配方、深度水解配方、氨基酸配方产品的基质主要是由肽、氨基酸、部分整蛋白（氨基酸配方产品不含）构成，不同于婴幼儿配方乳粉全部为整蛋白的基质，而肽、氨基酸的物理化学性质与蛋白质不同，造成检测过程中方法不适用的问题。其中，GB 5009.84—2016第一法基本适合检测婴儿配方产品及所检测特殊医学用途产品的VB1含量，但3 种配方都出现回收率偏低的情况。GB 5009.85—2016第一法适合检测婴儿配方产品以及特殊医学用途婴儿配方食品VB2含量，特殊医学用途婴儿配方食品产品中乳蛋白深度水解和氨基酸配方产品实验中出现回收率低的现象，需要更多的实验和数据进行确认。GB 5009.154—2016第一法适合检测婴儿配方产品和所检测特殊医学用途婴儿配方食品中部分水解配方和深度水解配方产品，不适用于氨基酸配方产品中的VB6检测。GB 5009.89—2016第二法适合检测婴儿配方产品中的烟酸，不适合特殊医学用途婴儿配方食品的检测。

食品中物质的检测，往往由于不同食品的基质不同，其方法的适用性也有所不同，该方法是否适用于被测样品，需进行方法适用性验证[29-30]。特殊医学用途婴儿配方食品中的VB1、VB2、VB6和烟酸在按照国标方法进行前处理时蛋白不易沉淀，出峰干扰较大，不同基质的食品前处理及检测分析的方法应有差别，可对现有的国标方法进行改进，以适用于特殊医学用途婴儿配方食品中的VB1、VB2、VB6和烟酸的检测[31]。