中国食醋中苯乳酸的检测、鉴定及其与醋酸的联合抑菌作用

宁亚维，侯琳琳，于同月，韩盼盼，付浴男，李明蕊，王志新，贾英民,*

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

苯乳酸是近年发现的一种新型有机酸，具有广谱的抑菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌均有良好的抑菌作用，如单核细胞增生李斯特菌[1]、沙门氏菌[2]、赭曲霉、罗克福青霉菌等[3-4]。苯乳酸天然存在于泡菜、酸面团等乳酸菌发酵的食品中[5-7]，可由大多数乳酸菌通过苯丙氨酸代谢途径发酵生产[8-10]。研究发现苯乳酸安全无毒，具有刺激免疫、减少肠道菌群中大肠杆菌的数量等生理作用[11-13]，上述优点使苯乳酸在食品发酵生产和生物防腐等方面受到广泛关注[14-15]。

食醋是最受欢迎的发酵调味品之一，在中国已有3 000多年的历史[16]，每天的消耗量超过320万 L。食醋除了具有调节酸度的作用外，还具有抑菌、降压和降胆固醇等保健功效[17]，但食醋的生物活性成分尚未完全阐明。据报道，乳酸菌是食醋发酵过程中的主要菌群之一，与食醋的风味和口感有关[18]。由于乳酸菌具有生产苯乳酸的能力，各种富含苯丙氨酸的谷物是制醋的原料（如糯米、高粱、稻米等），推测苯乳酸可以通过食醋中苯丙氨酸代谢途径产生[19-20]。此外，由于食醋对食源性致病菌具有广谱抑菌活性，除了醋酸、乳酸、柠檬酸等有机酸可发挥抑菌活性外[21]，是否还存在苯乳酸等其他尚未发现的有机酸有待进一步挖掘研究。因此，食醋中新型有机酸的分析检测具有重要的意义。本研究对食醋中的苯乳酸进行分离鉴定并建立超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱快速测定方法[22-24]，广泛分析我国市售食醋中的苯乳酸。在此基础上，通过时间杀菌曲线和扫描电镜技术首次考察苯乳酸与醋酸对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的联合抑菌作用。以期为我国食醋新功能的开发及苯乳酸在食品防腐中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

72 种食醋样品购自石家庄、上海、南京、天津和太原等多地超市，涵盖我国市售的大部分食醋种类，即陈醋（30 个样品）、香醋（15 个样品）、米醋（13 个样品）、白醋（5 个样品）、果醋（4 个样品）和其他醋（5 个样品）。

金黄色葡萄球菌ATCC 25923、枯草芽孢杆菌ATCC 6051、蜡样芽孢杆菌ATCC 11778、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 9027、荧光假单胞菌ATCC 13525分别来自中国工业微生物菌种保藏管理中心；单核细胞增生李斯特菌10403s由河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏。

苯乳酸标准品（色谱纯） 美国Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

LC-30A超高效液相色谱仪 日本岛津公司；QTRAP 6500 MS仪 美国AB SCIEX公司；3-18K冷冻离心机 德国Sigma公司；Labdancer S25旋涡混合器 广州仪科实验室技术有限公司；S-4800-I扫描电镜 日本日立公司；Adv-500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波谱仪 德国布鲁克公司；1525高效液相色谱仪（配备UV 2489检测器） 美国Waters公司；1200系列高效液相色谱-质谱系统 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 食醋中苯乳酸的纯化

将3 倍体积的甲醇加入食醋中沉淀蛋白质，离心收集上清液，用活性炭脱色。脱色前用盐酸（10 g/L）处理活性炭30 min，去离子水洗涤，在120 ℃真空干燥至恒质量，然后冷却至室温。将75 g/L活性炭加入pH 6.5的食醋中处理，在55 ℃、200 r/min脱色30 min，然后离心除去活性炭，再用旋转蒸发浓缩食醋混合物。

将上述预处理的食醋采用C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）纯化，配备UV 2489检测器的半制备高效液相色谱在波长210 nm处进行检测。流动相由0.05%三氟乙酸溶液（A）和0.05%三氟乙酸-乙腈溶液（B）组成，梯度洗脱以3 mL/min的流速进行。梯度洗脱：0～30 min，95%～65% A，5%～35% B；30～35 min，65% A，35% B；35～45 min，65%～95% A，35%～5% B。收集苯乳酸，蒸发浓缩冻干后得到苯乳酸纯品白色粉末。

1.3.2 食醋中苯乳酸的高效液相色谱-质谱和NMR鉴定

首先，采用1200系列高效液相色谱-质谱系统按照1.3.1节相同色谱柱和分离条件对食醋中苯乳酸的分子质量进行初步鉴定。选取负离子模式，质量扫描范围m/z100～1 000，采用氮气作为雾化气体。其次，对纯化后的苯乳酸进行NMR鉴定。采用DMSO-D6溶剂，使用NMR色谱仪记录1H和13C谱，采用Topspin 3.5pl7软件制作NMR波谱图。

1.3.3 食醋中苯乳酸检测方法的建立

1.3.3.1 流动相选择

采用配备双泵和自动进样器的LC-30A超高效液相色谱系统进行色谱分析。采用Phenomenex Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），通过等度和梯度2 种洗脱方式对苯乳酸进行分析，最终确定流动相为：0.3%甲酸溶液（A）和0.3%甲酸-乙腈溶液（B）；优化梯度程序：0～1 min，90% A，10% B；1～4 min，90%～10% A，10%～90% B；4～5 min，10% A，90% B；5～5.1 min，10%～90% A，90%～10% B；5.1～6 min，90% A，10% B。流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样量1 μL。

1.3.3.2 质谱条件的选择

采用QTRAP 6500系统和带有电喷雾离子源的四极杆质谱仪进行高效液相色谱-串联质谱分析。Analyst version 2.0软件用于仪器控制和数据采集。优化系统的负电离工作模式，并对目标化合物的监测条件进行优化。雾化气压力和辅助气压力分别设置为70 psi和60 psi。离子喷射电压－4 500 V，涡轮喷射温度500 ℃。碰撞室出口电位－12 V，入口电位－10 V，采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，在100 ms下对目标化合物进行MRM，为获得了最高的灵敏度和分辨率，在MRM模式下进一步优化裂解电压和碰撞能等参数。

1.3.3.3 样品的前处理

向1 mL食醋中加入3 mL甲醇振荡20 min，然后以10 000×g离心10 min，收集上清液过0.22 μm滤膜。然后采用高效液相色谱-串联质谱分析苯乳酸含量，其中谷物类食醋上清液稀释500 倍。

1.3.3.4 方法验证

采用线性范围、检出限、定量限、精密度、准确度等方法进行验证。采用溶剂和空白基质以8 种质量浓度（1～500 μg/L）建立校正曲线。采用醋酸溶液作为模拟基质制备空白基质，以食醋样品中质量浓度较高的600 mg/L醋酸溶液为模拟基质，按样品制备程序进行处理。根据基质匹配校准曲线与溶剂校准曲线的斜率比确定基质效应（信号抑制或增强）。分别根据RSN=3和RSN=10测定检出限和定量限。回收率为苯乳酸的实际质量浓度与添加到食醋样品中的已知质量浓度（50、100、200、700 mg/L）的比值，精密度为回收率测定的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），即重复性（日内RSD）和再现性（日间RSD）。

1.3.4 最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定

采用微量肉汤二倍稀释法利用96 微量孔板测定苯乳酸和醋酸的MIC。在96 微量孔板第1列分别加入苯乳酸和醋酸，用营养肉汤培养基在2～11列进行系列梯度稀释，第11列不加苯乳酸和醋酸为阳性对照，然后分别在1～11列中分别加入106CFU/mL菌悬液。12列只加营养肉汤为阴性对照，在37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，通过酶标仪测定吸光度，以细菌被抑制的最低苯乳酸和醋酸的浓度为MIC。

1.3.5 苯乳酸和醋酸协同抑菌活性

1.3.5.1 苯乳酸和醋酸联合抑菌指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）

根据Gutierrez等[25]报道的方法，采用棋盘法在96 微量孔板上测定苯乳酸和醋酸的FICI。通过二倍稀释分别制备质量浓度范围为1/32 MIC～4 MIC的苯乳酸和醋酸。不同MIC的苯乳酸以水平方向添加，醋酸以竖直方向添加。然后在棋盘中加入106CFU/mL菌悬液。37 ℃恒温培养箱中孵育24 h。FICI按下式计算：

FICI≤0.5，协同作用；0.5＜FICI≤0.75，部分协同，0.75＜FICI≤1，相加作用；1＜FICI≤2，无关作用；FICI＞2，拮抗作用。

1.3.5.2 时间杀菌曲线

以金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌为指示菌，采用菌落平板计数法考察苯乳酸和醋酸的协同抑菌动力学。将培养至对数期的指示菌接种于营养肉汤培养基中，分别加入苯乳酸、醋酸和2 种抑菌剂的组合，然后于37 ℃恒温培养。分别在0、2、4、6、8、12、24 h取样并通过稀释涂布平板法统计培养24 h后的活菌数。以时间为横坐标、活菌数对数值为纵坐标绘制时间杀菌曲线。根据Jacqueline等[26]的报道，与最有效的单一抑菌剂相比，抑菌剂组合作用后菌落数减少不小于2（lg （CFU/mL））定义为协同抑菌作用。

1.3.6 扫描电镜观察菌体形态

利用扫描电镜观察苯乳酸和醋酸对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌形态的影响。苯乳酸和醋酸处理的细菌在2.5%戊二醛溶液（0.1 mol/L PBS，pH 7.0）中4 ℃固定过夜。样品用PBS（0.2 mol/L PBS，pH 7.0）清洗重悬3 次，分别用30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液和2 次用100%乙醇脱水，然后用乙酸异戊酯置换乙醇2 次。样品干燥后采用扫描电镜观察菌体超微结构。

1.4 数据处理

所有实验均重复3 次取其平均值，采用PASW Statistics 20.0软件通过单因素方差分析法对实验数据进行分析，并通过Origin Pro8软件对实验结果进行作图，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 食醋中苯乳酸的高效液相色谱-质谱和NMR鉴定结果

食醋由于风味独特以及抗菌、降血压、降血脂、预防动脉粥样硬化等功能特性广受欢迎，但生物活性成分尚未完全阐明[21]。因此，采用高效液相色谱-质谱以电喷雾离子源模式分析食醋中的有机酸。由于具有酸性质子的化合物更容易形成[M－H]－离子，在电喷雾离子源负离子模式下易于被检测。食醋的质谱表明，在所有被测样品中均能检测到m/z164.9为[M－H]－离子的分子离子峰（图1A）。为了确认观察到的成分是苯乳酸，采用半制备高效液相色谱纯化镇江香醋6 a陈醋样品中的组分，并用1H-NMR（图1B）和13C-NMR（图1C）进行鉴定。结果表明，化学位移为δ175.65的C1原子为羧基，C6化学位移转移向低场（δ71.57）表明C6与羧基和羟基相连。质子信号在δ6.5～8.0，碳化学位移在δ110～150之间，表明化学结构中存在苯环。C2在δ138.71中的化学位移与未取代的苯环（δ128.5）相比向低场移动，对苯环中其他碳原子的化学位移没有显著影响，表明C2中苯环存在单取代基。C2的化学位移向低场移动δ10.21，表明C2与CH2（40.15/2.97，2.79）相连。因此，化学结构被鉴定为苯乳酸，结构如图1D所示，化学位移数据见表1。

图1 食醋中苯乳酸的结构鉴定图Fig.1 Structural characterization of PLA in vinegar

表1 食醋中苯乳酸的NMR鉴定数据Table 1NMR data for PLA in vinegar

2.2 食醋中苯乳酸的高效液相色谱-质谱测定

2.2.1 质谱条件优化

苯乳酸在中国食醋中是否常见以及含量多少尚不明确，因此有必要建立食醋中苯乳酸的检测方法。用电喷雾离子源对苯乳酸进行电离，并在MRM模式下进行分析。离子模式为负离子模式，在全扫描模式下以[M－H]－作为苯乳酸的母离子，子离子扫描时选定丰度高并且稳定的离子作定量离子。在MRM模式下优化裂解电压和碰撞能等参数，结果见表2。由图2可知，苯乳酸出峰时间为3.11 min，峰单一无干扰，表明优化的条件可用于苯乳酸的检测。

表2 优化的苯乳酸质谱条件Table 2Optimal MS/MS conditions for the determination of PLA

图2 食醋中苯乳酸的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram of PLA in vinegar

2.2.2 色谱优化

流动相对苯乳酸的分离至关重要，因此筛选了乙腈溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸溶液、0.3%甲酸-乙腈溶液和0.3%甲酸溶液等流动相进行苯乳酸的分离。综合考虑分析时间、峰形对称度和离子丰度等因素，流动相离子丰度最高的为0.3%甲酸溶液（A）和0.3%甲酸-乙腈溶液（B），梯度洗脱比等度洗脱效果好。优化后的洗脱程序见1.3.3.1节。

2.2.3 方法学验证

2.2.3.1 方法的线性范围及检出限

通过在模拟空白基质（60 mg/L醋酸溶液）中添加苯乳酸（1、10、20、50、100、200、300、500 μg/L）的校准曲线评估线性关系，如图3所示。校正曲线的回归方程表明，R2为0.999 8，线性良好。方法的基质效应为101.43%，表明食醋中苯乳酸检测时，离子的增强效应可以忽略不计。根据RSN=3和RSN=10分别确定谷物醋中苯乳酸检出限为0.6 mg/L，定量限为2 mg/L；白醋和果醋中苯乳酸检出限为1.2 μg/L，定量限为4 μg/L。

图3 苯乳酸在溶剂和模拟基质中的校准曲线Fig.3 Calibration curves for PLA in solvent and simulated matrix

2.2.3.2 精密度和准确度结果

通过回收率考察方法的准确度，如表3所示，方法平均回收率为82.1%～107.2%；通过分析重复性和再现性分析方法的精密度，即每个质量浓度作3 个平行，每个样品平行进样5 次分析，计算平均回收率和RSD。同一个样品于一天内5 个不同时段进样分析，获得日内精密度，连续3 d进行测定，取平均值并计算RSD。日内RSD和日间RSD分别为0.73%～4.30%和1.29%～4.99%，表明该方法具有较高的精度。利用MRM模式建立的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱方法具有较高的选择性，与Kuś等[27]采用的气相色谱-质谱法相比，无需进行酯化和萃取等繁琐的处理，且仅对蛋白质沉淀进行简单的预处理。与吴仁蔚等[28]通过高效液相色谱-串联质谱对77 种食醋中苯乳酸进行测定的方法相比，一个样品节省19 min，检出限可达1.2 μg/L，单次运行仅需6 min，与常用的高效液相色谱法单次运行25 min相比，具有节省时间和溶剂的优点[29]。此外，回收率测定结果具有较高的准确度，重复性较好，证明了测定方法的可行性。因此，该方法快速、简便、灵敏，适用于复杂食品基质中苯乳酸的测定。

表3 食醋样品中苯乳酸的加标回收率（n=5）Table 3Recoveries of PLA spiked into vinegar samples (n= 5)

2.3 我国市售食醋中的苯乳酸含量分析

续表4

采用建立的方法分析我国72 种食醋样品中的苯乳酸含量。除白醋和果醋外其他醋均属于谷物醋，占我国市场所售食醋总量的95%以上。如表4、5所示，所有食醋中均含有苯乳酸，且原料种类对苯乳酸浓度有显著影响。除白醋和果醋外，谷物醋中苯乳酸的平均质量浓度为（227.89±145.50）mg/L，57.14%的食醋中苯乳酸质量浓度高于200 mg/L，高于其他发酵食品如泡菜（49.5±5.0）mg/L、发酵乳（21.8±0.3）mg/L中苯乳酸含量[7,30]。食醋中苯乳酸的存在与乳酸菌有关，因为乳酸菌是食醋发酵过程中的主要菌种之一，乳酸菌发酵可以产生苯乳酸[31-32]。此外，据推测苯乳酸可能有助于提升食醋的风味，类似现象也发现于蓟蜜研究中，研究显示蓟蜜的风味与苯乳酸纯品的风味密切相关[33]。该发现为乳酸菌对食醋发酵风味和口感的提升提供了科学依据[18]。然而，醋酸菌对苯乳酸的产生是否有影响有待进一步研究。此外，苯乳酸在谷物醋中的标准差为145.50 mg/L，表明在食醋中的含量变化范围很大，造成差异的主要原因包括原料（稻米、糯米、高粱）、发酵方式（固态和液态深层发酵）、微生物和陈化时间等方面。

表4 谷物醋中苯乳酸含量Table 4Concentration of PLA in cereal vinegar

另一方面，白醋和果醋中苯乳酸含量极少，最高质量浓度仅为（1.07±0.05）mg/L，推测与白醋特殊的生产工艺有关。我国白醋主要由醋酸菌发酵乙醇产生，包装前经过脱色处理，因此原材料中苯丙氨酸前体的缺乏限制了苯乳酸的合成[9]。此外，白醋制备中的脱色过程也会导致苯乳酸的损失。该发现与Giumanini等[34]关于苹果醋的报道类似，即果汁原料中苯丙氨酸含量少是醋中苯乳酸含量低的主要原因。

2.4 生产工艺对谷物食醋中苯乳酸质量浓度的影响

为了考察生产工艺对食醋中苯乳酸质量浓度的影响，分别对原料、发酵方式和陈化时间进行统计分析。结果显示（图4A），发酵方式是影响食醋中苯乳酸质量浓度的关键因素，固态发酵食醋的苯乳酸平均质量浓度比液态深层发酵高4.84 倍。原料对苯乳酸的质量浓度也有显著性差异（P＜0.05），以糯米为原料的食醋苯乳酸质量浓度最高，为（398.36±98.17）mg/L；以稻米为原料的苯乳酸质量浓度最低，为（92.05±102.05）mg/L。同样，香醋、陈醋和米醋中苯乳酸含量具有显著性差异（P＜0.05），香醋苯乳酸质量浓度最高，其次是陈醋，最少的是米醋（图4B）。另外，在陈化时间方面，从2 个品牌的4 个样品中可以看出，陈化时间与苯乳酸质量浓度呈正相关。但由于样本量小，比较的食醋可能来自不同的发酵批次，陈化时间的比较缺乏统计学意义。因此，陈化时间对苯乳酸质量浓度的影响将实地工厂取样进一步研究。本研究所发现的发酵过程与苯乳酸含量的相关性可为食醋生产的质量控制提供参考依据。

图4 生产工艺对食醋中苯乳酸含量的影响Fig.4 Effect of fermentation mode, raw material and vinegar type on the concentration of PLA in vinegar

2.5 苯乳酸与醋酸的联合抑菌活性

鉴于食醋中苯乳酸含量难以达到抑菌效果，因此考察苯乳酸与醋酸的联用抑菌效应。如表6所示，苯乳酸MIC范围为1.25～2.25 mg/mL，醋酸MIC在0.5～1.75 mg/mL之间，表明苯乳酸与醋酸抑菌效应相当。FICI为0.375～1，苯乳酸与醋酸对除铜绿假单胞菌外的其他食源性致病菌和腐败菌均呈协同和部分协同抑菌作用，苯乳酸与醋酸共存时能增强苯乳酸的抑菌作用。

表6 苯乳酸与醋酸对食源性致病菌和腐败菌的联合抑菌作用Table 6Synergistic effect of PLA with acetic acid against foodborne pathogenic and spoilage bacteria

通过时间杀菌曲线和扫描电镜考察苯乳酸与醋酸联用对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的协同抑菌作用。如图5所示，单独使用苯乳酸（0.31 mg/mL）和醋酸（0.31 mg/mL）对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌均无抑制作用，而两者联用可完全抑制两株菌的生长，证实了苯乳酸和醋酸的协同抑菌效应，同时也表明食醋中苯乳酸能够通过与醋酸协同作用发挥抑菌活性。如图6所示，未经处理的金黄色葡萄球菌细胞具有规则的球形形态和完整的细胞膜，单独使用苯乳酸（1/4 MIC）和醋酸（1/2 MIC）处理的细胞有轻微皱褶和微量内容物渗漏，而苯乳酸（1/4 MIC）和醋酸（1/2 MIC）联合处理的金黄色葡萄球菌细胞损伤严重，内容物显著泄露，说明苯乳酸和醋酸能够协同增强细胞形态的破坏，且破坏程度与苯乳酸（MIC）和醋酸（MIC）相似。此外发现，苯乳酸和醋酸联用处理的鼠伤寒沙门氏菌形态更容易发生改变，外表面皱缩更为严重，但未有明显的内容物泄露。课题组基于苯乳酸和醋酸对大肠杆菌抑菌机理研究发现[35]，两者协同可以改变大肠杆菌的细胞表面电荷分布，消散细胞膜电势，引起细胞发生形变，破坏基因组DNA从而发挥抑菌作用。而不同食源性致病菌和腐败菌由于自身结构不同而具有不同的抑菌方式，后续将进一步研究苯乳酸和醋酸联用对食源性致病菌和腐败菌的抑菌机理。

图5 苯乳酸和醋酸对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的时间杀菌曲线Fig.5 Time-kill curves of PLA and acetic acid against S.aureus and S.typhimurium

图6 苯乳酸和醋酸对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌影响的扫描电镜图Fig.6 SEM micrographs of S.aureus and S.typhimurium treated with PLA and/or acetic acid

3 结 论

本研究建立一种简便、快速、灵敏的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定食醋中苯乳酸的含量，并应用该方法对72 种食醋进行了测定，发现所有食醋中均含有苯乳酸。统计分析表明，原料和发酵方式对食醋中苯乳酸含量有显著影响，以糯米为原料固态发酵制备的食醋中苯乳酸含量最高。抑菌实验结果表明，苯乳酸与醋酸对大多数食源性致病菌和腐败菌均具有协同抑菌作用。本研究结果发现苯乳酸普遍存在于食醋中，其含量与食醋的生产工艺密切相关，有利于食醋生产中的质量控制；苯乳酸与醋酸具有协同抑菌作用，可为苯乳酸在食品生物防腐中的应用提供科学依据。