定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

时 旭，刘 瑛，史海粟，武俊瑞，乌日娜，牛雪晴，洛 雪*，岳喜庆*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 112000）

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一类含有共轭双键的十八碳二烯酸（亚油酸）异构体混合物。最常见与健康相关的活性异构体是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA，天然的CLA主要在动物、植物、海产品中，反刍动物如牛羊乳脂和肉制品中含量较高[1-2]。CLA具有多种生理活性，如抗肿瘤[3-5]、抗动脉粥样硬化[6-8]、降脂[9]、降糖[10]、调节免疫[11-12]等，逐渐受到相关研究者的关注。孙丽婷等[13]发现，CLA异构体对人体乳腺癌细胞中MCF-7细胞的增殖具有抑制和促进凋亡的作用, 其中t9,t11-CLA最有效。Maria等[14]用CLA对两种细胞进行处理，最终核磁共振光谱证明CLA具有潜在的抗癌功能。Li Shili等[15]通过对正常小鼠和肥胖小鼠进行正常饮食和喂食t10,c12-CLA发现，t10,c12-CLA对小鼠的影响受膳食脂肪含量和肥胖程度的影响。

CLA的合成方法主要是化学合成法和生物合成法，化学法主要包括碱性异构化、金属催化异构化、酶催化亚油酸异构化、羟基脂肪酸脱水等[16]。但此法合成的CLA含有多种异构体，c9,t11-CLA 和c10,t12-CLA含量不高，分离过程复杂。

相较之下，生物合成的CLA成分单一更为安全，目前具有合成CLA能力的菌株中转化率较高的是瘤胃细菌、丙酸杆菌和乳酸菌等[17]。研究发现，生产c9,t11-CLA的多酶体系和生产t10,c12-CLA的单酶体系是目前主要的亚油酸异构酶作用机理。Kishino等[18]首次确定了植物乳杆菌由三酶体系生产CLA；Yang Bo等[19]又对植物乳杆菌ZS2058的亚油酸异构酶三段基因mcra、dh、dc进行敲除，证明了由3 种组分亚油酸异构酶催化生产CLA的独特机制。Jenkins等[20]以碳标记的亚油酸（linoleic acid，LA）为示踪底物，得到亚油酸异构酶参与LA氢化的过程，LA先异构成CLA，最终产物为硬脂酸，证明CLA仅为该反应的中间产物。

易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术作为酶制剂定向进化的主要方法之一，具有应用范围广、突变随机性强、方法实用的特点，无需详细了解蛋白质结构，就可以对已知基因序列的蛋白进行适度的随机突变，提高突变多样性，从而获得所需的突变体[21]。如Wang Chen等[22]对赖氨酸脱羧酶进行定向进化，所得突变体对尸胺的生产率提高了1.48 倍；Nshimiyimana等[23]对易错PCR、位点饱和突变进行了总结，发现经过改造的L-氨基酸脱氨基酶可提高苯丙酮酸、α-酮异己酸、α-酮异戊酸、α-酮戊二酸、α-酮-γ-甲基硫代丁酸和丙酮酸的产量。还有研究发现，经过两轮易错PCR和两代连续的DNA改组后，L-天冬酰胺酶I的活性显着增加，催化活性最高可提高21.33 倍[24]。同时该技术在提高酪氨酸酚裂解酶[25]、dirhodium cyclopropanases[26]、木聚糖酶[27]、L-天冬酰胺酶[28]等酶活性方面也取得了显著效果，有助于研究酶三维结构中关键氨基酸的改变和产酶机理。

本研究先对植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因进行克隆并异源表达于Arctic(DE3)大肠杆菌菌株中，利用易错PCR技术对两种菌的亚油酸异构酶基因进行体外突变，构建亚油酸异构酶突变体库，得到高产CLA的菌株，从而提高c9,t11-CLA和t10,c12-CLA的产量，选择的两种菌株产生两种不同的CLA，植物乳杆菌主要产生c9,t11-CLA，痤疮丙酸杆菌主要产生t10,c12-CLA，研究旨在利用定向进化的方法获得两种亚油酸异构酶高产菌株，为研究亚油酸异构酶产酶机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌HAC01 实验室保藏；痤疮丙酸杆菌CICC10864 中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD18-T质粒 宝生物工程（大连）有限公司；Arctic(DE3)表达菌 新海基因生物科技有限公司；pCold-SUMO质粒 丰晖生物科技有限公司；pCold-gfp质粒 实验前期制备；细菌DNA提取试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司；易错PCR试剂盒 北京百奥莱博科技有限公司；LA 上海联迈生物工程有限公司；CLA 美国Sigma公司。植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌设计引物的GenBank登录号分别为HM569265和CP044255。

MRS培养基：2%葡萄糖，1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.5%酵母膏，0.5%乙酸钠，0.2%磷酸氢二钾，0.2%柠檬酸氢二铵，0.058%硫酸镁，0.05%L-半胱氨酸盐酸盐，0.025%硫酸锰，0.1%吐温80；pH 6.2；用于培养植物乳杆菌。1053培养基：1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.3%酵母粉，0.5%葡萄糖，0.5% NaCl，0.1%可溶性淀粉，0.05%L-半胱氨酸盐酸盐，0.03%乙酸钠；pH 6.8；用于培养痤疮丙酸杆菌。LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl；pH 7.0；用于培养大肠杆菌。

1.2 仪器与设备

LX-B50L型高压灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；THZ-100恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司；nexus gradient PCR仪、Centrifuge 5430R小型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；PowerPac Basic十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）仪美国伯乐公司；DYY-6C型电泳仪电源 北京六一生物科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司；BD FACSAria III流式细胞仪 美国BD公司；Cary50紫外分光光度计 美国Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因的克隆

使用试剂盒提取植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌DNA，并在反应第2步中加入溶菌酶孵育协助破壁[29-30]。以植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌DNA作为模板，用mcra-up、mcra-down和lai-p-up、lai-p-down引物对（表1），分别PCR扩增亚油酸异构酶系的植物乳杆菌肌球蛋白交叉反应抗原（myosin-cross-reactive antigen，MCRA）基因mcra和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因lai-p，反应程序见表2。将回收的mcra和lai-p与T载体于25 ℃连接30 min，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃扩大培养，PCR验证后，送交上海桑尼生物科技有限公司进行测序。质粒标为pT-mcra和pT-lai-p，含有该质粒的菌株标记为T-mcra和T-lai-p。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

表2 植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因克隆PCR程序Table 2PCR programs for the cloning of mcra andlai-p

1.3.2 植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因的表达

将克隆的质粒pT-mcra、pT-lai-p和pCold-SUMO用SacI/HindIII在37 ℃双酶切2 h，回收mcra（SacI/HindIII）、lai-p（SacI/HindIII）和pCold（SacI/HindIII），将mcra（SacI/HindIII）和lai-p（SacI/HindIII）分别与pCold（SacI/HindIII）用T4酶25 ℃连接30 min，转化到Arctic(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，37 ℃扩大培养，通过PCR验证和双酶切验证后，在16 ℃用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达18 h，之后进行SDS-PAGE验证表达情况。

1.3.3 易错PCR扩增

以克隆成功的mcra、lai-p为模板，易错PCR扩增体系为30 μL：10×易错PCR Mix 3 μL、10×易错PCR专用dNTP 3 μL、5 mmol/L MnCl23 μL、10 ng/μL DNA模板1 μL、10 pmol/μL引物各1 μL、5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL、超纯水补至30 μL，PCR扩增条件见1.3.1节。

1.3.4 亚油酸异构酶突变体库的构建

对经过两轮易错PCR的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，合格产物胶回收后，用限制性内切酶SacI/HindIII对易错PCR回收产物和pCold-gfp质粒进行双酶切，胶回收产物用T4酶25 ℃连接30 min，转化到Arctic(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，构建突变重组菌，加入IPTG诱导表达，构建亚油酸异构酶突变体库。构建的质粒图谱如图1所示。

图1 pCold-ycmcra-gfp 质粒（a）和pCold-yclai-p-gfp质粒（b）图谱Fig.1 Maps of pCold-ycmcra-gfp vector (a) and pCold-yclai-p-gfp vector (b)

1.3.5 正突变子的筛选

以未经过易错PCR的目的基因所构建的重组菌作为阴性对照，通过流式细胞仪将荧光性高于对照组的单克隆子分选到装有200 μL含Amp（100 mg/mL）的LB培养基的96 孔板中，37 ℃振荡培养至菌体生长，再将菌液扩培，测定发酵液中的吸光度，选出吸光度提高和CLA产量增加菌株。

1.3.6 CLA含量测定

以0.5%的接种量接种含100 mg/mL Amp的LB培养基，培养至OD600nm为0.5～0.6，加入0.5 mg/mL LA和IPTG在16 ℃诱导表达24 h，获得发酵液。发酵液于10 000×g、4 ℃离心10 min获得菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液冲洗2 次，转移菌体至预冷的研钵，用液氮迅速研磨成粉末，菌体粉末溶于磷酸盐缓冲液，冰水浴超声破碎，超声仪以工作10 s-暂停5 s、15 min、400 W为条件工作，然后4 ℃、10 000×g离心30 min转移上清液，获得亚油酸异构酶粗酶液。取2 mL粗酶液加入LA至质量浓度为0.5 mg/mL，37 ℃振荡培养4 h，结束后加入8 mL氯仿和4 mL甲醇，充分振荡，离心后取上层有机层氮气吹干，加入正己烷溶解剩余脂质加入硫酸钠干燥，于233 nm波长处测定上清液吸光度，根据标准曲线计算CLA含量[31]。标准曲线所选取的测定点分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μg/mL，CLA母液质量浓度为0.5 mg/mL。

1.4 数据处理

数据统计方法为Duncan新复极差法，绘图所使用的软件为Origin85和Winplas2.7。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因的克隆

检验构建的T-mcra重组菌和T-lai-p重组菌， PCR结果见图2。pT-mcra和pT-lai-p分别在1 700 bp和1 300 bp的位置有清晰条带，与预计的片段大小相符。将PCR验证呈阳性的菌株送交公司测序，结果显示，T-mcra重组菌目的基因连入长度1 695 bp，编码564 个氨基酸；T-lai-p重组菌目的基因连入长度1 275 bp，编码424 个氨基酸，与NCBI数据库中两种菌的相应基因进行对比，无氨基酸突变。对克隆成功菌株T-mcra重组菌和T-lai-p重组菌的质粒用SacI/HindIII进行双酶切实验。如图3a所示，得到mcra片段大小1 700 bp，如图3b所示，lai-p片段大小1 300 bp，T载体大小2 700 bp，pCold-SUMO双酶切片段大小4 700 bp，与预期相符。结果显示，克隆过程得到的相应基因mcra和lai-p，它们大小与文献所述相同[32-33]，目的条带清晰，氨基酸序列、引物和酶切位点没有突变情况，说明克隆成功，可用于后续实验。

图2 pT-mcra 质粒（a）和pT-lai-p质粒（b）的PCR验证Fig.2 PCR identification of pT-mcra plasmid (a) and pT-lai-p plasmid (b)

图3 pT-mcra 质粒（a）和pT-lai-p质粒（b）的双酶切实验结果Fig.3 Double restriction enzyme digestion of pT-mcra plasmid (a) and pT-lai-p plasmid (b)

2.2 植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因的表达

2.2.1 重组大肠杆菌的构建

将pT-mcra和pT-lai-p质粒经过双酶切胶回收后所得的mcra和lai-p，由T4连接酶与pCold-SUMO连接，构建重组菌，以pCold-SUMO转化的Arctic(DE3)菌作为对照组，将该重组菌菌株标记为P-mcra和P-lai-p。检验P-mcra和P-lai-p重组菌，提取质粒进行PCR验证，结果见图4，mcra大小为1 700 bp，lai-p大小为1 300 bp，与预期结果相符。质粒双酶切验证如图5，P-mcra重组质粒和P-lai-p重组质粒均可见2 条清晰的目的条带，一条约在4 700 bp，一条约在1 700 bp和1 300 bp，pCold-SUMO质粒的对照条带也在4 700 bp左右，说明重组菌构建成功。

图4 植物乳杆菌mcra基因（a）和痤疮丙酸杆菌lai -p基因（b）转化Arctic(DE3) PCR验证Fig.4 PCR identification of transformation of mcra (a) and lai-p (b)into Arctic(DE3)

图5 双酶切验证Fig.5 Validation by double restriction enzyme digestion

2.2.2 IPTG诱导表达的SDS-PAGE

将重组菌P-mcra、P-lai-p、pCold-SUMO转化的Arctic(DE3)菌和Arctic(DE3)菌，IPTG低温诱导表达，用SDS-PAGE检验亚油酸异构酶基因表达情况，结果见图6。mcra基因表达蛋白约为70 kDa，lai-p基因表达蛋白约为55 kDa，与对照组没有亚油酸异构酶基因的pCold-SUMO和Arctic(DE3)菌的诱导表达结果相比，说明蛋白表达成功。

图6 阳性重组菌SDS-PAGE结果Fig.6 SDS-PAGE profiles showing expression of mcra and lai-p in E.coli

在较低的诱导温度和较低的IPTG 浓度条件下，可以得到更高表达量的可溶性重组蛋白，减少不溶性蛋白的表达量，可以使mcra和lai-p基因表达蛋白在菌体内大部分正确折叠，提高蛋白的表达效率。由SDS-PAGE结果可知，植物乳杆菌mcra基因表达分子蛋白大小约为70 kDa，可能是由于重组蛋白N端融合了His tag和载体序列，其分子质量比预计的65 kDa稍大一些[34]；痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶表达蛋白的大小约为55 kDa，与文献报道一致[35]。两种蛋白表达情况的不同，可能与其作用机理、催化产生不同种类的CLA和酶的结构有关。

2.3 mcra和lai-p的突变及突变体库的构建

2.3.1 易错PCR法构建的突变体库

为提高mcra和lai-p的突变率，采用了连续多次的易错PCR方法，每一轮易错PCR电泳检测合格后，产物进行胶回收，用于下一轮的易错PCR，连续进行3 轮易错PCR后，所得胶回收产物电泳结果如图7所示，图7a所得条带均在1 700 bp，图7b所得条带均在1 300 bp，由于3 轮易错PCR条带亮度及带宽逐渐降低，为保证目的基因的完整性，选择2轮易错PCR胶回收产物作为构建突变体库的目的基因，两种菌株的目的基因分别为ycmcra和yclai-p。实验前期构建了pCold-gfp重组质粒，将ycmcra、yclai-p和重组质粒pCold-gfp用SacI/HindIII双酶切，用T4连接酶连接后，转化到Arctic(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，构建pCold-ycmcra-gfp和pCold-yclai-p-gfp突变重组菌。

图7 mcra（a）和lai-p（b）易错PCR结果Fig.7 Error prone PCR of mcra (a) and lai-p (b)

2.3.2 流式细胞仪的分选

带有绿色荧光蛋白基因标签的重组菌和重组突变菌，在经过流式细胞仪时，可以筛选出荧光强度高的菌株，以未突变的重组菌pCold-mcra-gfp和pCold-lai-pgfp作为对照组，如图8a、b所示，越过P2门的菌分别为1.5%和1%，图8c、d结果显示，含有pCold-ycmcra-gfp和pCold-yclai-p-gfp的突变重组菌总数分别为11 883 株和12 079 株，即两种突变重组菌的突变体库分别包含11 883 个和12 079 个突变子，越过P2门的菌株占所有分选菌株的58.7%和3.6%，占越过P1门菌株整体的98.2%和7.4%，即其中98.2%和7.4%的突变子荧光强度高于对照菌，用96 孔板对部分荧光强度高的单克隆子进行收集培养，收集pCold-ycmcra-gfp单克隆子282 株，pCold-yclaip-gfp单克隆子174 株。

图8 流式细胞仪分选结果Fig.8 Screening of mutants by flow cytometry

由于gfp与mcra基因和lai-p基因是共表达的，推测gfp表达量高的重组菌有可能mcra基因和lai-p基因表达量也高，因此采用这种筛选方法，此筛选方法对于前期的筛选十分快速，可以有效筛选到细胞活性更好同时目的基因表达量提高的菌株，后续还会依靠CLA产量复筛重组子。

流式细胞术作为一种快速的筛选方式，通过对gfp基因的识别，适合作为初筛得到有gfp基因、ycmcra基因和yclai-p基因的重组菌株，初筛得到的菌株再测定CLA产量进行复筛，可以更高效得到CLA产量提高菌株。通过流式细胞仪筛选时设置的P1门和P2门，以未突变重组菌作为对照，P2门左侧为对照组重组菌，P2门中的即是在荧光强度上高于对照组的突变重组菌，由此间接认定这些突变重组菌的mcra基因表达量和亚油酸异构酶表达量高于对照组重组菌，进而达到初筛的目的。

相比之下，pCold-yclai-p-gfp重组菌分选所得菌株的荧光性高于对照株的明显少于pCold-ycmcra-gfp重组菌，造成这种结果的原因可能是基因组突变不多，yclai-p与pCold-gfp的连接性不如ycmcra与pCold-gfp的连接性，连接转化不完全，gfp的表达性不够好；也可能是pColdyclai-p-gfp的突变重组菌种生长过旺，gfp表达性好的菌株凋亡过多，造成分选结果不太理想。

2.4 pCold-ycmcra-gfp重组菌吸光度和pCold-yclai-p-gfp重组菌CLA含量测定结果

根据文献[36-38,19]可知，植物乳杆菌催化LA生成CLA是三酶体系的结构，本实验中突变的mcra与该酶系中的MCRA具有高度同源性，即pCold-ycmcra-gfp重组菌作用LA后的产物为10-羟基-顺,12-十八碳酸（10-HOE）。对分选出来的282 株pCold-ycmcra-gfp重组菌和174 株pColdyclai-p-gfp重组菌测定在233 nm波长处的吸光度，以得到mcra和lai-p基因的正向突变重组菌。测定的CLA标准曲线为y=0.074 2x+0.002 3（R2=0.999 1），pCold-mcragfp重组菌未突变菌株的吸光度为0.174 6±0.000 2，其中pCold-ycmcra-gfp重组菌吸光度提高的菌株有243 株，提高率86.2%；pCold-lai-p-gfp重组菌未突变菌株的CLA产量为（2.91±0.000 0）μg/mL，pCold-yclai-p-gfp重组菌CLA产量提高的菌株有156 株，提高率89.6%，分选的结果中仍有少量吸光度和CLA产量降低的菌株，可能是因为分选时有非目标菌株与目标菌株间发生黏连[39]，被分到同一个孔中，进而一起生长；也可能有部分荧光蛋白表达量高的菌株并没有表现出酶蛋白的高表达量；还有可能存在仪器性能、菌株状态、样本处理等方面的问题[40-41]。但此种方法分选出的菌株中大部分仍为有益突变株，仍然可以快速高效地分选出所需的菌株，同时减少了测定所有突变菌株CLA产量的工作量，此方法已被洛雪[33]证明是有效的。如表3所示，pCold-ycmcra-gfp重组菌有27 株吸光度提高了4 倍以上，其中提高最多的为155号菌，吸光度为1.050 6±0.004。如表4所示，pCold-yclai-pgfp重组菌有16 株CLA产量提高在2.5 倍以上，其中产量最高的为39号菌，CLA产量为（11.62±0.003 6）μg/mL。

表3 pCold-ycmcra-gfp重组菌的吸光度Table 3Absorbance of recombinant pCold-ycmcra-gfp and its mutants

表4 pCold-yclai-p-gfp 重组菌CLA产量Table 4Production of CLA in recombinant pCold-yclai-p-gfp and its mutants

3 结 论

本研究克隆亚油酸异构酶系的mcra基因和lai-p基因，经PCR、双酶切验证和基因测序，得到阳性菌株T-mcra和T-lai-p，将mcra和lai-p基因与pCold-SUMO连接，构建重组菌株，利用IPTG进行低温诱导表达。经过SDS-PAGE检验，mcra基因和lai-p基因蛋白大小约为70 kDa和55 kDa，与预期大小一致。利用易错PCR技术突变mcra和lai-p，构建携带绿色荧光蛋白基因的pColdycmcra-gfp和pCold-yclai-p-gfp突变重组菌，依据菌体荧光蛋白发光特性，通过流式细胞仪分选出吸光度增加和CLA产量提高的菌株，其中pCold-ycmcra-gfp重组菌243 株，吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4，提高5.02 倍；pCold-yclai-p-gfp重组菌156 株，产量最高的为39号菌（11.62±0.0036）μg/mL，产量提高2.99 倍。为后续构建高产CLA的重组菌株和亚油酸异构酶催化机制的研究提供了前期基础。