白酒贮存过程中主要成分间氢键相互作用的量子化学计算

黄张君，张文华，曾运航,*，石 碧，王松涛，沈才洪

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000；3.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000）

中国白酒是以粮谷为主要原料，用酒曲作糖化发酵剂，经发酵、蒸馏、贮存、勾调而成的含有酒精的饮料[1-2]。经蒸馏而得的白酒新酒因气味刺激、口感粗糙辛辣，需要经过一段时间的贮存才能使杂味消失、口感变得柔和。这一贮存过程也被称为白酒的陈酿或者老熟，是提升白酒品质和价值极为重要的生产环节[3]。关于白酒经贮存后口感会发生变化的原因，目前主要有“缔合说”、“挥发说”、“溶出说”、“酯化说”和“氧化说”五种理论[4]。其中，“缔合说”对于揭示白酒的老熟行为有着重要的意义。它推测正是新酒中游离的乙醇分子使酒的口感燥辣，经过贮存乙醇可以与水通过氢键形成较为稳定的缔合体，从而降低酒体对味觉器官的刺激作用[5-6]。

白酒的主要成分是乙醇和水，其占比约为98%，其余约2%为酯类、酸类、醇类、醛酮类等微量成分[7]。这些微量成分的含量以及它们之间的相互作用对酒体感官质量和风味特征起决定性作用[8]。在蒸馏酒中，与各成分间的疏水相互作用、静电作用力、范德华力相比，乙醇-水的氢键作用占有主导地位，被认为是酒体缔合机制中最重要的机制之一。近年来，研究酒体中乙醇-水氢键及其影响因素的工作越来越多[9-11]。乔华等[12]通过荧光分析法研究清香型白酒中乙醇-水的缔合行为，发现贮存时间并没有影响白酒中乙醇-水的缔合强度，而酒体中主要的微量成分会改变乙醇-水的缔合强度。郑飞云等[13]分析酒类风味物质对乙醇-水体系的核磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）中质子化学位移的影响，结果表明异丁醇、丙酮酸、乳酸等与乙醇-水的氢键缔合呈现正相关。Nose等[14]采用1H-NMR分析蒸馏酒中影响乙醇-水氢键缔合强度的关键因素，发现有机酸和酚类物质有助于乙醇-水的氢键缔合。综上可知，酒中的风味成分影响乙醇与水的缔合行为，进而影响酒体的感官质量和风味特征。但是，由于白酒中的风味成分以小分子物质为主，且组分复杂、含量低，很难通过现有的仪器检测手段直接获取分子结构和它们相互作用的热力学数据，因此尚需引入其他方法继续验证和补充白酒贮存过程中的“缔合说”。

量子化学利用量子力学研究化学问题，随着计算机科学的发展，它已经被应用于化学、医学、食品等领域[15-17]，弥补了传统实验手段的不足，可以更深入地研究和认识各种物质的结构和性质的本质。高斯（Gaussian）是最早的量子化学计算程序之一，支持多种量子化学计算理论和计算方法，能够实现几何结构优化、红外和拉曼光谱计算、化学键能计算、热力学参数计算等功能[18-19]。量子化学有不同的计算方法，其中密度泛函理论（density functional theory，DFT）是通过密度函数替代波函数，将能量视为电子密度函数的一种计算方法[20]。DFT计算量适中、计算精度较高，目前使用广泛，其已被证明用于研究氢键相互作用十分有效[21]。李晓燕等[22]采用DFT研究了丝氨酸与水的相互作用，计算丝氨酸与水之间的氢键键能大小，获得丝氨酸-水复合物最稳定的存在形式；Kannan等[23]用DFT对不同形式缔合的甲酰胺-甲醇复合物进行分析，通过计算各种复合物的氢键键长和键能，阐释了甲酰胺和甲醇之间相互作用的本质。Li Yunkui等[24-25]用DFT研究葡萄酒花色苷与多酚的相互作用，探明了分子间氢键对葡萄酒体系的稳定起着重要作用。

为了进一步在分子水平上研究白酒中乙醇、水与风味成分之间的相互作用，本实验拟选取白酒中的主要风味成分，采用DFT方法对乙醇-水、乙醇-风味成分、水-风味成分以及乙醇-水-风味成分复合物的几何构型以及氢键相互作用进行研究，以期为更深入地认识白酒中乙醇、水和风味成分之间的相互作用提供基础数据和理论指导，丰富白酒的老熟机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓香型白酒原酒（新酒样品）及其贮存1 a后的酒样，乙醇体积分数为69.8%，由泸州某著名浓香型白酒生产企业提供。

叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、正丙醇、正丁醇、3-甲基丁醇、正戊醇、正己醇、β-苯乙醇、乙醛、乙缩醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、糠醛、2-丁酮、3-羟基-2-丁酮（均为色谱纯，纯度＞98.0%） 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GC2010-FID气相色谱-氢火焰检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、LC-20AT高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 日本岛津公司；DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、TC-C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒样品主要风味成分的含量检测

1.3.1.1 GC-FID检测

白酒样品中主要挥发性化合物的含量采用GC-FID进行检测。GC条件：DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；气相进样口温度250 ℃；进样量1 μL，分流进样，分流比为50∶1；升温程序：色谱柱初始温度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温至100 ℃，再以6 ℃/min升温至230 ℃，保持15 min；载气为氮气，流速1.0 mL/min；FID温度250 ℃。

采用内标法定量（内标叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸），以待测物与相应内标物质的峰面积比为纵坐标，质量浓度比为横坐标，计算待测物的质量浓度。样品平行测3 次，求平均值。各种挥发性化合物质量浓度的变化幅度按式（1）计算：

式中：CS0为新酒样品中挥发性化合物的质量浓度/（g/L）；CS1为新酒贮存1 a后酒样中挥发性化合物的质量浓度/（g/L）。

1.3.1.2 HPLC检测

白酒样品中乳酸的质量浓度采用HPLC进行检测。色谱柱为Agilent TC- C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.02 mol/L KH2PO4溶液（磷酸调节pH值至2.7），A-B（5∶95，V/V）等度洗脱；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温40 ℃；紫外检测器检测波长210 nm。

1.3.2 白酒中主要成分相互作用的量子化学计算

运用Gaussian 09程序[26]进行理论计算，用GaussView 5.0.8进行结构可视化。采用密度泛函B3LYP-D3理论方法[27]，在6-31G(d)基组水平上对所有单体（乙醇、水、风味成分）和复合物（乙醇-水、乙醇-风味成分、水-风味成分、乙醇-水-风味成分）进行结构优化和频率振动分析，得到各单体和复合物的稳定几何构型及热力学参数，并确保所得到的结构是势能面上的极小值。采用B3LYP-D3理论方法，在6-311G(d, p)基组水平上对经过结构优化的单体和复合物进行单点能计算，然后计算相互作用能。为排除基组重叠误差（basis set superposition error，BSSE）的影响，使用Boys等[28]提出的完全均衡校正法对优化后的复合物结构进行BSSE校正。相互作用能（ΔE）按式（2）、（3）计算：

式中：ΔEAB为复合物AB的相互作用能；EAB为复合物AB的总能量；EA和EB分别为单体A和B的能量；BSSEAB为复合物AB的基组重叠误差校正能。

式中：ΔEABC为复合物ABC的相互作用能；EABC为复合物ABC的总能量；EA、EB和EC分别为单体A、B和C的能量；BSSEABC为复合物ABC的基组重叠误差校正能。

1.4 数据处理

通过Microsoft Office Excel 2016进行相应的数据处理和分析，使用Origin 2018软件作图，分子结构作图使用GaussView 5.0.8软件。

2 结果与分析

2.1 白酒中的主要风味成分分析

白酒中含有丰富的风味成分，包括酯类、酸类、醇类、醛类、酮类、芳香族化合物等多种物质[29]。由表1可知，酯类物质质量浓度最高的为四大酯，即己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯；酒样中的有机酸按质量浓度高低排序依次为己酸、乙酸、乳酸、丁酸；醇类也是白酒中含量较高的一类风味成分，按质量浓度高低排序依次为正丁醇、正丙醇、3-甲基丁醇、正己醇。

表1 不同贮存期白酒主要风味成分质量浓度Table 1Concentrations of major flavor compounds in Baijiu during different storage times

在贮存过程中，这些风味成分的质量浓度会随贮存时间推移而发生变化。新酒在贮存1 a后，酯类成分的质量浓度下降了0.91%～20.42%；除乙酸外，酸类成分的质量浓度增加了3.73%～12.11%。酒中含量较高的酯类和酸类成分呈现出“酸增酯减”的变化趋势，这与李冰川等[30]的研究结果一致。“酸增酯减”主要是因为酒中的酯类成分通过水解作用生成相应的酸类和醇类成分。除正戊醇（质量浓度增加1.12%）和β-苯乙醇（质量浓度减少14.29%）外，醇类物质的质量浓度下降了0.50%～3.57%，整体降幅较小，且沸点越低的物质，降幅越大。产生上述现象的原因主要是在白酒的贮存过程中物质受到挥发作用的影响[31]。乙醛、3-甲基丁醛、糠醛的质量浓度降低，而乙缩醛和2-甲基丁醛的质量浓度有所增加。其中，乙缩醛质量浓度的增加主要是因为酒中的乙醇和乙醛发生缩合反应生成乙缩醛。2-丁酮和3-羟基-2-丁酮的质量浓度分别增加了6.67%和6.58%。3-羟基-2-丁酮的质量浓度随贮存时间的延长增加，这主要是由其前体物2,3-丁二醇通过氧化作用生成了3-羟基-2-丁酮[32]。

2.2 量子化学计算结果

2.2.1 乙醇/水-风味成分二元复合物分析

根据白酒的“缔合说”可知，白酒在贮存过程中，乙醇和水可以通过氢键作用形成缔合体，使酒体口感的刺激性减弱，一些风味成分有促进酒体中氢键缔合的作用[6]。由此可见，深入认识白酒中各种成分分子之间的相互作用机制，不仅对阐释白酒的老熟机理有意义，对白酒生产贮存条件的优化和提升产品品质同样具有指导意义。将乙醇/水与白酒中含量较高且具有代表性的风味成分（乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸、乳酸、丁醇、己醇）按1∶1比例建立计算模型，用量子化学研究乙醇-水、乙醇-风味成分、水-风味成分复合物的氢键结构。在B3LYP-D3/6-31G(d)基组水平上对各复合物可能的结构进行优化和频率分析，得到各复合物稳定的构型和氢键结构参数，如图1和表2所示。乙醇/水与这些风味成分形成的氢键键长为1.72～2.07 Å，键角为136.8°～166.1°，这些值均在氢键范畴内[33]。一般而言，形成复合物的过程是一个能量降低的过程，若复合物稳定存在，则ΔE为负值，且复合物越稳定，ΔE越低。由图2可知，乙醇/水与风味成分之间的ΔE为负值，表明乙醇/水-风味成分复合物能稳定存在。

图2 乙醇/水与风味成分二元复合物的相互作用能Fig.2 Interaction energy of the binary complexes of ethanol/water and flavor compounds

表2 乙醇/水与风味成分二元复合物的结构参数Table 2Structural parameters of the binary complexes of ethanol/water and flavor compounds

图1 乙醇/水与风味成分二元复合物的优化结构Fig.1 Optimal structures of the binary complexes of ethanol/water and flavor compounds

根据相关文献报道[34]，当乙醇的羟基氧原子作为氢键受体，水分子作为氢键的质子供体时，乙醇-水二聚体的结构最为稳定。因此，本实验采用此二聚体结构建模计算，优化后的结构参数为乙醇-水氢键的键长1.89 Å，键角165.6°，ΔE为－24.80 kJ/mol。

酯类成分乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯均含有一个酯基，酯基中的羰基O原子作为受体，能与乙醇/水的羟基H原子形成一个氢键，氢键键长为1.90～1.94 Å。乳酸乙酯分子中由于含有酯基和羟基2 个官能团，因此可以和乙醇/水通过氢键作用形成环状结构，使乙醇-乳酸乙酯复合物的ΔE为－59.81 kJ/mol，为所有乙醇/水-风味物质复合物中最低。由此可见，在白酒中质子性溶剂乙醇和水对乳酸乙酯的溶剂化作用[35]明显强于乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯，故理论上乳酸乙酯的水解反应更难发生。由表1可知，白酒贮存1 a后，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯的质量浓度分别下降了9.01%、2.03%、6.75%和3.39%。乳酸乙酯质量浓度的下降幅度明显小于乙酸乙酯和己酸乙酯，这与量子化学计算结果吻合。而丁酸乙酯的降幅也较少，可能是因为丁酸乙酯在四大酯中含量最低，检测时存在相对误差。此外，乳酸乙酯与乙醇/水复合物的结构最稳定，应该也是当浓香型白酒中乳酸乙酯含量过高时，在贮存过程中难以降低而影响白酒品质的原因，因此通常需要在发酵阶段通过微生物作用控制乳酸乙酯含量保证白酒的品质[36]。与水-酯复合物相比，乙醇-酯复合物的氢键键长更短、ΔE更低，这说明乙醇-酯缔合体比水-酯缔合体更稳定。酯类成分可以赋予白酒令人愉悦的花果香[37]，但在贮存过程中会因挥发和水解作用减少[38]。根据上述量子化学计算结果可以看出，在贮存过程中增加乙醇浓度应该有利于维持酒中酯类成分的稳定，这也很可能是目前贮存的白酒原酒保持高乙醇浓度风味更好的原因之一。

酸类成分乙酸、丁酸和己酸各含有一个羧基，羧基中的羰基O原子和羟基H原子可以分别与乙醇/水的羟基H原子和O原子形成氢键，乙醇/水-酸复合物通过2 个氢键进一步形成了环状结构，其ΔE为－46.96～－44.68 kJ/mol，是乙醇/水-风味成分（除乳酸乙酯）复合物中稳定性最高的。乳酸含有羧基和羟基2 种官能团，对比复合物a-8-01、a-8-02、b-8-01和b-8-02的计算结果，乳酸的羧基与乙醇/水的羟基形成的复合物结构更稳定。与水-酸复合物相比，乙醇-酸复合物的氢键键长更短、ΔE更低，这说明乙醇-酸缔合体的结构比水-酸缔合体更稳定。白酒在贮存过程中，酯类成分会通过水解作用生成对应的酸和醇类成分，酸和醇类成分也可以通过酯化反应生成对应的酯，水解和酯化反应互为可逆反应。由量子化学计算结果可知，乙醇/水-酸缔合体比乙醇/水-酯缔合体更稳定，所以该可逆反应更容易向水解方向进行，这应该是白酒随贮存时间延长出现酸增酯减变化趋势的原因之一。

醇类成分丁醇和己醇含有一个羟基，其羟基O原子作为质子受体能与乙醇/水的羟基H原子形成一个氢键。乙醇-醇复合物的ΔE比水-醇复合物的ΔE低，可见乙醇-醇缔合体更稳定，这正是醇类物质，如丁醇、己醇，可与乙醇混溶而微溶于水的原因。综上所述，乙醇/水-风味成分复合物的稳定性排序为乙醇/水-酸类＞乙醇/水-醇类＞乙醇/水-酯类。

续表2

2.2.2 乙醇-水-风味成分三元复合物分析

白酒中乙醇和水约占白酒总质量的98%，其中乙醇在原酒和成品白酒中的体积分数约为72%～38%。为进一步阐释乙醇、水共同存在时风味成分与它们之间的氢键相互作用，将乙醇、水和风味成分按照分子数1∶1∶1比例建立计算模型，研究乙醇-水-风味成分三元复合物的结构参数和相互作用能，结果如图3、表3和图4所示。乙醇-水-风味成分复合物的氢键键长为1.60～2.20 Å，键角为122.3°～177.9°。乙醇-水-风味成分复合物的ΔE为负值，可见它们可以稳定存在。

表3 乙醇、水和风味成分三元复合物的结构参数Table 3Structural parameters of the ternary complexes of ethanol,water and flavor compounds

图3 乙醇、水和风味成分三元复合物的优化结构Fig.3 Optimal structures of the ternary complexes of ethanol, water and flavor compounds

乙醇-水-乙酸乙酯、乙醇-水-丁酸乙酯和乙醇-水-己酸乙酯复合物中均有2 个氢键，一个是水分子的羟基O原子与乙醇分子的羟基H原子形成的氢键，另一个是水分子的羟基H原子和酯基的羰基O原子形成的氢键。乙醇-水-乳酸乙酯复合物中有3 个氢键，与上述的3 种复合物相比，多了1 个由乳酸乙酯的羟基O原子和水的H原子形成的氢键。因此，在乙醇-水-酯复合物中，乙醇-水-乳酸乙酯的ΔE最低，结构最稳定。乙醇-水-酸复合物中有3 个氢键，这些氢键分别由水的H原子和乙醇的羟基O原子、水的O原子和酸中羟基的H原子、乙醇的羟基H原子和酸的双键O原子形成，且通过氢键作用乙醇、水和酸3 个分子形成了环状结构。乙醇、水和丁醇/己醇也能通过氢键连接成环状的三元复合物。

由图4可知，乙醇-水-风味成分三元复合物的结构稳定性由强到弱排序为乙醇-水-酸＞乙醇-水-醇＞乙醇-水-酯，与乙醇/水-风味成分二元复合物的结构稳定性趋势一致，说明酸类成分能更稳定地存在于乙醇-水中，其次为醇类成分。对比表1可以发现，贮存过程白酒中的酯类成分整体减少，酸类成分除乙酸外，均有所增加，醇类成分有减小的趋势，但降幅小于酯类成分。由此可见，白酒中风味成分含量的增减与乙醇-水-风味成分三元复合物稳定性的强弱呈正相关。此外，三元复合物中乙醇-水-酸的结构最为稳定，说明在白酒贮存过程中酸可以参与乙醇-水的氢键缔合，形成更稳定的缔合体。这一结果与Nose等[39]发现的酸类化合物可以增加威士忌酒中乙醇-水的氢键缔合强度，王夺元等[40]提出的有机酸能促进白酒酒体更快达到缔合平衡等结论相互映证。对比图2和图4可以看出，与乙醇-水、乙醇-风味成分、水-风味成分二元复合物相比，乙醇-水-风味成分三元复合物的氢键键长更短，ΔE更低，这说明在三元复合物中氢键缔合作用变强。这些量子化学计算数据量化表征了白酒中各种成分之间由于氢键相互作用而产生的缔合现象，证明了氢键相互作用能使酒体的游离分子减少，分子团簇增加，提高白酒体系的稳定性。

图4 乙醇、水和风味成分三元复合物的相互作用能Fig.4 Interaction energy of the ternary complexes of ethanol, water and flavor compounds

3 结 论

白酒中主要成分间相互作用的量子化学计算结果表明，在乙醇/水-风味成分二元复合物中，乙醇/水-酸复合物最稳定，其次为乙醇/水-醇和乙醇/水-酯复合物。需要指出的是，乳酸乙酯含有酯基和羟基2 个官能团，可以和乙醇/水通过氢键相互作用形成环状结构，乙醇/水-乳酸乙酯复合物的稳定性高于乙醇/水-酸复合物。乙醇-酯复合物比水-酯复合物更稳定，这应该是在贮存过程中高浓度的乙醇有利于保存酒中的酯类成分和香味的原因之一。乙醇-水-风味成分三元复合物的结构稳定性由高到低排序为乙醇-水-酸＞乙醇-水-醇＞乙醇-水-酯，与乙醇/水-风味成分二元复合物的结构稳定性趋势一致。这从理论上证明了白酒在贮存过程中呈现的“酸增酯减”的变化有利于增强酒体中氢键的缔合作用，减少酒体的游离分子。用量子化学作为研究手段，能更深入地认识白酒中各成分分子间的相互作用机制，为阐释白酒的老熟机理提供基础数据，同时对优化白酒的贮存条件和提升产品品质提供理论指导。