东北狍ARL3基因cDNA克隆及序列分析

薛梦迪，杨鸿源，马占宇，夏彦玲

（东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040）

鹿茸角是所有哺乳动物组织中唯一可以循环再生的器官，能够周期性生长脱落［1］，其发育是一个非常独特的复杂过程，涉及到软骨内成骨和膜内成骨等骨生长方式，许多研究表明鹿茸再生是基于干细胞（骨膜细胞），不涉及细胞的去分化，和蝾螈肢体再生过程不相同［2］。

鹿茸角是鹿茸和鹿角的总称，是鹿科雄性动物（驯鹿除外）的第二性征。东北狍属于一种中小型鹿科食草动物，刘继华等［3］的研究表明，狍茸和鹿茸中的化学成分基本相同，都拥有生精补髓、益血壮阳、强筋健骨、促进造血、增强机体免疫力等功效［4］。

近年来有研究表明，ARL3基因参与细胞内微管调节和蛋白转运，且和多种生物学过程的发生、发展有关［5］，尤其是与人类脑部发现的原发性恶性肿瘤［6］有着密切的关联。人们对ARL3基因与鹿科动物茸角生长相关性方面知之甚少。为此，本试验对东北狍（Capreolus pygargus）茸角中的ARL3基因进行克隆和序列分析，为深入探讨鹿科动物茸角生长发育的分子调控机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

选取一头人工驯养的健康成年东北狍（来源于大兴安岭加格达奇地区）作为试验动物，在未骨化的狍茸顶端组织中选取大约4 cm样品，采集样品时应注意使用严格消毒的手术刀。将采集到的样品放入冻存管，再放置于液氮中保存，备用。

1.2 主要试剂和仪器

RNA提取试剂盒、pMD 18－T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞，均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；M－MLVⅢ逆转录酶，购自TOYOBO公司；胶纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶快速纯化回收试剂盒，购自Galen Biopharm公司；紫外分光光度计（型号为Ultrospec 2100 Pro），购自General Electric公司。

1.3 试验步骤

1.3.1 总RNA的提取及cDNA合成 将保存于液氮中的试验样品约50 mg取出并研磨至粉末状，按照RNA提取试剂盒说明提取狍茸顶端组织的总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光法检测总RNA的质量。以提取的狍茸尖端组织总RNA为模板，加入抑制剂RNase Inhibitor、底物dNTP Mixture、引物Oligo－dT、以M－MLVⅢ逆转录酶反转录合成cDNA。

1.3.2 东北狍ARL3基因的克隆 参照GenBank中牛、白唇鹿等物种的基因序列设计同源引物（上游引物5′－GCGGGAGGATGGGCTTAC－3′和下游引物5′－ATCTACGGCTGGAATGGGG－3′）。PCR扩增包含ARL3基因全部编码区的cDNA序列，PCR反应体系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2.0μL，上下游引物各1.0μL，rTaqDNA聚合酶0.2μL，ddH2O 17.3μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54.5℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min；在4℃进行保存。将产物经过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，确认得到目的基因后，利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收产物连接到pMD18－T载体上，转化到大肠杆菌DH5α中，涂板，于37℃过夜培养。挑取转化菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养6～8 h，经PCR阳性克隆检测后送往库美生物科技有限公司进行测序。

1.3.3 生物信息学分析 采用ORF程序的ORF Finder软件查找序列的开放阅读框，并使用Prot-Param和ProtScale在线程序预测蛋白的基本理化性质及其亲水性。用Signal P 3.0软件预测蛋白信号肽，用TMpred软件预测蛋白跨膜结构，在PSORTⅡ在线服务器中预测蛋白亚细胞定位。通过GOR4预测该蛋白的二级结构，用SWISSMODEL对该蛋白的三级结构进行同源建模分析，并使用NetPhos 2.0和NetAcet 1.0 Server对ARL3蛋白磷酸化位点和乙酰化位点分别进行预测，用NCBI上的CD－Search Tool预测蛋白功能结构域，用MEGA7软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 东北狍ARL3基因总RNA的提取及cDNA克隆

1%琼脂糖凝胶电泳检测提取狍茸顶端组织总RNA，RNA条带中28 S、18 S和5 S均无降解现象，见图1。这说明提取的总RNA质量较好。PCR扩增获得1条约721 bp的条带，见图2。该条带与预期目的基因片段大小一致。转化后经阳性克隆获得了721 bp的条带，表明成功获得目的基因。

图1 RNA完整性检测结果

图2 PCR电泳图谱

2.2 东北狍ARL3基因的生物信息学分析

2.2.1 ARL3基因的cDNA序列分析 本试验获得的ARL3基因的cDNA序列长度为721 bp，使用ORF Finder软件对目的片段的开发阅读框进行查找，显示ARL3基因cDNA 序列的编码区包含549 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，共编码182个氨基酸，见图3。

图3 东北狍ARL3基因cDNA编码区及编码氨基酸序列

2.2.2 东北狍ARL3蛋白基本理化性质 东北狍ARL3蛋白包含182个氨基酸，其组成中亮氨酸含量最高，占12.64%。该蛋白不稳定系数为44.63，存在16个疏水区和25个亲水区，亲水平均系数为－0.312，该蛋白的亲水性较强；理论等电点为6.83。SignalP 3.0预测结果显示该蛋白无信号肽。用TMpred软件进行的跨膜结构预测表明，该蛋白为非跨膜蛋白。亚细胞定位预测分析的结果表明ARL3基因编码的蛋白存在于细胞质、细胞核、线粒体的概率分别是69.6%、21.7%、4.3%。

2.2.3 东北狍ARL3二级和三级结构预测分析 GOR4软件预测显示该蛋白的二级结构组成为61个氨基酸组成无规则卷曲，84个氨基酸组成α－螺旋，37个氨基酸组成延伸链，分别占46.15%、33.52%、20.33%，见图4。运用ExPASy中的SWISS－MODEL的程序对ARL3蛋白的三级结构进行同源建模，结果表明，与输入目标序列的一致度为96.11%，GMQE值为0.88，见图5。该模型图表明东北狍ARL3蛋白主要由α－螺旋与无规则卷曲构成，此结果与二级结构预测结果基本相同。

图4 二级结构预测分析

图5 三级结构模型

2.2.4 东北狍ARL3蛋白磷酸化位点、乙酰化位点和糖基化位点分析 对东北狍ARL3蛋白磷酸化位点的预测表明，该蛋白含有1个苏氨酸和5个丝氨酸磷酸化位点，分别是第103位苏氨酸和第12，43，58，94，137位丝氨酸，不存在酪氨酸磷酸化位点。乙酰化位点预测结果显示有一个序列（—MGLLS）存在乙酰化修饰。ARL3蛋白中含有20个糖基化位点，其连接位点是甘氨酸。

2.2.5 东北狍ARL3蛋白结构域分析 利用CD Search Tool在线工具进行结构域分析，结果（见图6）显示，ARL3蛋白3～175位氨基酸含有一个ARL3蛋白活性结构域，与P－loop＿NTPase超家族相似度很高。ARL3结构域中包含多个功能活性结合位点，包括2个开关转换区：switchⅠ和switchⅡ；一个酶类作用位点：GTP／Mg2＋结合位点（GTP／Mg2＋binding site）。

图6 蛋白功能结构域预测

2.3 东北狍ARL3蛋白系统进化树的构建

在NCBI网站下载8个物种ARL3蛋白氨基酸序列，并用MEGA7软件构建系统进化树，结果见图7。结果表明，东北狍与白尾鹿亲缘关系最近，与野牦牛、长江江豚、非洲爪蟾的亲缘关系较近，与家猫、美洲河狸等的亲缘关系较远，此进化树符合进化关系，并且与物种传统分类学地位相符。

图7 东北狍ARL3蛋白的系统进化树

3 讨论

本试验中，成功克隆了含有东北狍ARL3基因编码区的cDNA序列，其中CDS区全长549 bp，共编码182个氨基酸。生物信息学分析发现，ARL3蛋白为亲水性蛋白质且不存在信号肽。经ARL3基因的蛋白质序列比对构建系统进化树，发现东北狍与白尾鹿亲缘关系最近，与野牦牛、长江江豚、非洲爪蟾的亲缘关系较近，与家猫、美洲河狸等的亲缘关系较远，符合传统的分类学进化关系。ARL3蛋白质磷酸化修饰发生的位点是丝氨酸和苏氨酸，可能与信号传导、细胞周期、生长发育以及癌症机制有关。其蛋白的O－糖基化连接位点是甘氨酸，许多隐藏的膜结合蛋白在甘氨酸上发生O－糖基化，这些糖蛋白中大多数为黏液糖蛋白，常称黏蛋白。黏蛋白组成了富含多聚糖的膜相关蛋白和分泌性糖蛋白大家族，它们由上皮细胞分泌，是保护黏膜上皮的物理和生物屏障。许多重要的生物进程，包括上皮细胞表层的保护、免疫应答、黏附、炎症和肿瘤发生等，都是由黏蛋白或带有黏蛋白样结构域的糖蛋白控制和／或调节的［7］。

ARL3结构域中包含GTP／Mg2＋结合位点，当与GTP结合时ARL3蛋白呈现激活状态，当GTP水解为GDP时，蛋白为非激活构象。Mg2＋离子在促进switchⅠ和switchⅡ功能区与磷酸根结合中起到了关键作用，通过激活态与非激活态之间的转变来完成信号传递的“开”与“关”，进而调控信号传导通路和物质代谢［8］。

ARL3蛋白在人脑发育的早期（包括小脑）以及发育中的视网膜和肾脏中表达，研究表明，它通过调节睫状体运动参与睫状疾病的发生，影响肾脏和光感受器的发展［9］。此外，ARL3基因参与多种生物学过程和肿瘤的发生、发展，调节多种基本的细胞功能，如膜转运、细胞骨架组织、细胞黏附和迁移等细胞活动，它在免疫突触和初级纤毛中起着浓缩脂质修饰蛋白的作用［10］，可以作为评估胶质瘤预后的生物标志物，亦或是一个胶质瘤治疗的靶点。鹿茸能够像肿瘤一样快速生长，鹿茸快速生长期细胞增殖速度是癌细胞增值速度的30倍［11－12］。在鹿茸生长过程中，细胞的分化、增殖、凋亡都受到特定基因表达的调控。

综上所述，ARL3基因的存在与癌细胞的增殖和转移有着密切的关系，可能也与鹿茸顶端组织快速生长密不可分。本试验通过对ARL3基因编码序列的克隆，对ARL3基因的结构和功能进行了初步分析预测，研究结果为进一步揭示ARL3基因的功能及表达调控机制提供依据，也为狍茸角的生长发育机制提供一定的理论依据。