不同产地高节竹竹叶次生代谢物与土壤微生物的关系分析

徐小博 王选年 徐 萍 岳永德 汤 锋 王 进 姚 曦

（1.新乡学院生命科学与基础医学学院，河南 新乡 453003；2.国际竹藤中心，北京 100102）

土壤是影响植物次生代谢成分的主要因素，土壤微生物是土壤生态系统的核心，土壤微生物不仅对土壤动植物残体和土壤有机物质及其他有害化合物的分解起到重要作用，而且在土壤养分循环和土壤结构变化中的作用也不能忽视，在一定程度上可以反映土壤肥力状况及其生产力水平[1-3]。例如丛枝菌根（AM）真菌是土壤生态系统中广泛分布的优秀微生物资源，AM 真菌通过根内菌丝与宿主植物体形成营养上的互利共生关系，在促进植物生长、提高抗逆性、改良土壤结构等方面的作用效果显著[4]。药用植物与根际微生物互作一直是研究的热点[5]。黄花蒿（Artemisia annua）、刺五加（Acanthopanax senticosus）和鱼腥草（Houttuynia cordata）等药用植物的次生代谢产物与土壤因子关系[6-8]、以及土壤有益菌对植物次生代谢产物影响的研究较多[9]。通过对野生黄花蒿（Artemisia annua）土壤特征对药用次生代谢产物的影响研究发现，土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性与青蒿素、青蒿酸含量呈显著或极显著正相关。提高土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性能够提高黄花蒿的青蒿素、青蒿酸含量[6]。金司阳等从植物−土壤反馈角度结合次生代谢产物的含量方法，分析了刺五加幼苗在植物−土壤反馈中的次生代谢产物的变化情况[7]。竹叶中含有丰富的黄酮类、有机酸等次生代谢产物，有重要的药用价值，但存在活性成分含量不稳定等问题[10-11]。植物产地是影响植物次生代谢产物的重要因素之一，不同地区环境中微生物种类和优势菌群不尽相同[11-12]。竹子次生代谢产物的研究多集中在次生代谢产物的种类和时间变化上[13-14]，但地域差异对竹叶次生代谢产物影响的研究较少，竹叶次生代谢产物的产地差异及其与竹林土壤微生物特征之间的关系尚不清楚。此外，竹叶中次生代谢产物会通过淋溶、凋落物等途径进入土壤，对土壤微生物群落产生影响，进而间接影响植物的生长发育，这个问题也同样值得关注。

高节竹（Phyllostachys prominens）为禾本科竹亚科刚竹属的重要经济竹种，是一种集观赏、生态防护、笋用、材用于一体的多用竹种，主要在分布浙江，全国多地有引种，经济价值高[15]。因此，本研究以高节竹为试材，测定了不同产地高节竹竹叶次生代谢产物含量以及土壤中3 种土壤微生物数量、微生物生物量和土壤酶活性，探讨竹叶中次生代谢产物含量与土壤微生物因子的相关性。本研究为了解土壤微生物对竹叶次生代谢产物积累的影响，以及不同竹林目标化种植和提高次生代谢产物累积的研究提供参考。

1 研究地概况

由南向北选择4 个有高节竹分布或者引种的代表性研究地，分别为江苏南京、浙江富阳、江西南昌、福建武夷山。研究地的基本概况如下：1）江苏南京：位于南京市溧水区东南部的南京林业大学白马基地（119°10′～119°11′E、31°35′～31°36′N），属亚热带季风气候。年平均气温15.4 ℃年，平均降雨量1106.5 mm。2）浙江富阳：位于杭州市富阳区永昌镇（119°25′～120°19.5′E、29°44～30°11′N），属中亚热带季风气候。年平均气温16.1 ℃，年平均降水量1 426 mm。3）江西南昌：位于南昌市梅岭国家森林公园塘下村（115°48′～115°49′E、28°44′～28°45′N），属亚热带季风气候，年平均气温17～17.7 ℃，年平均降雨量1600～1700 mm。4）福建武夷山：位于福建省武夷山风景区（117°24′12″～118°02′50″E，27°32′36″～27°55′15″N），属典型的亚热带季风气候，年平均气温8.5～18.0 ℃，年平均降雨量1 482～2 150 mm。

2 材料与方法

2.1 竹叶样品采集和处理

在4 个研究地，选择高节竹试验林经营水平一致，长势良好的高节竹竹林，分别设置3 个20 m×20 m 的样地，每个样地 中随机设 置3 个3 m×3 m 的小样方。在每个小样方采集竹叶，采集立竹年龄为2 a 的上、中、下部的健康叶片，然后混匀，取样量500 g。每个试验地共9 个竹叶样品。样品采集后自然阴干至恒质量，粉碎，保存于4 ℃冰箱中。竹叶采样时间在2018 年9 月中旬。

2.2 土壤样品的采集

在2.1 的每个样地内布设5 个土样采集点，采集0～20 cm 深度的土壤样品，取样时去除土壤表层凋落物及其他杂物，并剔除土壤中植物根系和石块。每个样品采样量为1.0 kg 左右，共20 份样品，装入无菌袋放于带冰块的泡沫箱内，带回实验室，用于土壤微生物数量、土壤微生物生物量及土壤酶活性的测定。

2.3 仪器与试剂

Waters 2695 型高效液相色谱仪，Waters 2487二极管阵列检测器；异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁、木犀草苷、苜蓿素7−O−葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素（纯度>98%）（上海源叶生物生物技术有限公司）；色谱乙腈，（美国Fisher 公司）。

2.4 高效液相色谱检测方法

标准溶液配制、样品制备及HPLC 检测条件参考魏琦等的方法[16]，10 种次生代谢产物标准品的高效液相色谱见图1。按照保留时间依次是异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁、木犀草苷、苜蓿素7−O−葡萄糖苷、木犀草素和芹菜素。

图1 10 种次生代谢产物标准品的高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of 10 secondary metabolites

2.5 土壤微生物相关指标的测定方法

细菌、真菌和放线菌数量测定参考许光辉等[17]和王理德等[18]的方法，微生物数量用cfu/g（每克样品的菌落数）表示。

土壤微生物生物量碳（SMBC）和生物量氮（SMBN）测定参考文献[19]方法。蛋白酶活性和脲酶活性的测定采用比色法测定[20]，蔗糖酶活性采用3,5−二硝基水杨酸比色法[21]。

2.6 数据分析与处理

采用Microsoft Excel 2010 计算数据平均值、标准差等，并完成图表制作。采用SPSS 19.0 软件进行Pearson 法相关分析。

3 结果与分析

3.1 不同产地高节竹竹叶次生代谢含量分析

由表1 可知，4 个产地高节竹竹叶中所含次生代谢产物种类一致，被检测的次生代谢产物总量在1.777 9～3.176 2 mg/g，其中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、苜蓿素7−O−葡萄糖苷含量高于其他成分。不同产地高节竹竹叶中异荭草苷的含量在0.877 3～2.133 6 mg/g，其中，浙江富阳最高，是福建武夷山（最低）的2.43 倍。各产地竹叶中荭草苷含量在0.308 2～0.573 1 mg/g。各产地竹叶中牡荆苷含量在0.167 1～0.258 9 mg/g，浙江富阳的显著高于其他3 个产地，是江苏南京（最低）的1.55倍。各产地竹叶中苜蓿素7−O−葡萄糖苷含量在0.101 8～0.256 3 mg/g。浙江富阳的最高，是江西南昌（最低）的2.52 倍，但和江苏南京差异不显著。各产地的对香豆酸的含量在0.007 9～0.020 5 mg/g，异牡荆苷的含量在0.008 9～0.016 5 mg/g，芦丁的含量在0.044 1～0.061 3 mg/g，木犀草苷的含量在0.053 2～0.144 9 mg/g，芹菜素的含量在0.010 0～0.028 5 mg/g。4 个产地均未检测到木犀草素。

表1 4 个产地竹叶样品中9 种次生代谢物的含量Table 1 Contents of 10 secondary metabolites from 4 producing areas mg/g

3.2 不同产地高节竹林土壤微生物相关指标分析

由表2 可知，4 个研究区的土壤微生物总量由高到低依次是福建武夷山、浙江富阳、江苏南京和江西南昌。福建武夷山的土壤细菌数量最高，为17.50×106cfu/g，依次分别是浙江富阳（9.25×106cfu/g）、江苏南京（8.94×106cfu/g）和江西南昌（7.36×106cfu/g），其中浙江富阳和江苏南京两地差异不显著。土壤真菌数量为江苏南京土壤样品最高，为3.99×104cfu/g，显著高于其他3 个产地，浙江富阳、江西南昌和福建武夷山的土壤真菌数量相互之间差异显著。福建武夷山的放线菌数量显著高于浙江富阳、江西南昌和江苏南京，为4.33×104cfu/g，江苏南京和江西南昌竹叶样品之间差异不显著。

表2 不同产地竹林土壤3 种微生物数量的比较Table 2 Comparison of soil microbial quantity in bamboo from different producing areas cfu/g

由表3 可以看出，浙江富阳的土壤样品SMBN显著高于福建武夷山、江西南昌和江苏南京。浙江富阳的土壤样品SMBC 最高，依次分别是江西南昌、江苏南京和福建武夷山的土壤样品。江西南昌和福建武夷山的样品的SMBN 之间差异不显著；福建武夷山样品的SMBC 显著低于其他地区的，浙江富阳和江苏南京样品的SMBN 差异不显著。

表3 不同产地土壤微生物量碳和氮及3 种土壤酶的比较Table 3 Comparison of soil microbial biomass C and N,and 3 enzyme activities from different areas

由表3 可以看出，来自江苏南京土壤样品的脲酶和蔗糖酶活性显著高于其他地区的，4 个产地样品中浙江富阳的蛋白酶活性最高，依次分别是福建武夷山、江苏南京、江西南昌；江苏南京的土壤脲酶活性最高，依次分别是福建武夷山、江西南昌和浙江富阳。江苏南京的高节竹林土壤蔗糖酶活性最高，依次分别是江西南昌、福建武夷山和浙江富阳。

3.3 竹叶次生代谢含量与土壤微生物的相关性分析

由表4 可知，竹林土壤细菌数量与竹叶中荭草苷、对香豆酸和牡荆苷含量存在正相关关系，与异荭草苷、异牡荆苷、芦丁、木犀草苷、苜蓿素−7−O−葡萄糖苷、芹菜素和总量存在负相关关系；土壤真菌数量与竹叶中异荭草苷和木犀草苷含量存在显著正相关关系，与荭草苷、对香豆酸和牡荆苷存在负相关关系；土壤放线菌与荭草苷、对香豆酸、牡荆苷含量存在正相关关系，与异荭草苷、异牡荆苷、芦丁、木犀草苷、芹菜素和次生代谢产物总量存在负相关关系；微生物量氮和微生物量碳均与竹叶中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、木犀草苷、苜蓿素−7−O−葡萄糖苷和次生代谢产物总量存在正相关关系，与对香豆酸、异牡荆苷和芹菜素存在负相关关系，其中与对香豆酸含量存在显著负相关关系。高节竹竹叶次生代谢相关产物的含量与土壤中3 种酶活性的相关性不显著。说明土壤酶活性不是活化土壤所吸收养分的主要因素。

表4 竹叶次生代谢产物含量和土壤微生物的相关性Table 4 Correlation between content of secondary metabolites in bamboo leaves and soil microorganism

4 结论与讨论

1）不同产地次生代谢物差异。植物所含次生代谢产物含量的高低除与遗传因素有密切关系外，所生存的环境和气候条件等生态因子对其也有很大的影响。本研究中高节竹竹叶中代谢产物的总量具有明显的地域差异，表明竹叶中次生代谢产物的合成和积累受环境因子的影响较大。各气象因子如温度、湿度、光照、大气以及生物之间的影响程度等综合决定的环境因子对植物次生代谢过程的影响，所以环境因子并不是孤立地对植物体内次生代谢产物含量起作用，而是多种因素不断变化[22]。

2）土壤微生物数量与竹叶次生代谢物的关系。植物体内次生代谢物的量和土壤微生物存着相互关系。土壤微生物也会通过参与土壤有机质分解、矿质元素运输而影响植物自身次生代谢物的合成，尤其是一些土壤有益菌发挥的作用更不容忽视。植物根际促生菌（PGPR）和菌根真菌（AM）对植物生长、养分吸收和次生代谢物的产生具有有益的影响，这些植物的次生代谢物包括酚类、黄酮、生物碱等[3,23]。相关性分析表明竹林土壤细菌数量与竹叶中荭草苷、对香豆酸和牡荆苷含量存在正相关关系。研究也发现土壤微生物与鱼腥草次生代谢相关产物存在相关性。细菌群与阿福豆苷和槲皮素含量呈极显著正相关，细菌群落对于酚类物质中的阿福豆苷、槲皮苷、槲皮素的代谢累计起到一定的促进作用[24]。推测某些竹林土壤细菌的生理活动，影响了土壤养分及根系，进而促进了竹叶中荭草苷、对香豆酸和牡荆苷的生物合成及积累。土壤真菌数量与竹叶中异荭草苷和木犀草苷含量存在显著正相关关系，推测在高节竹竹林土壤可能存在某些菌根真菌，能通过菌丝体将矿质营养运输到植物根际供其吸收，促进高节竹体内某些次生代谢产物合成，值得进一步研究。

3）土壤酶活性与竹叶次生代谢物的关系。本研究还发现4 个产地竹叶中异荭草苷的含量均显著高于其他成分，浙江富阳的异荭草苷的含量最高，同时该地土壤中蛋白酶活性也最高，推测土壤蛋白酶也间接影响着异荭草苷的生物合成，有机质中的绝大多数化合物不能直接被植物吸收利用，需要借助土壤中微生物释放的酶来分解[25-26]。但通过显著性分析发现高节竹竹叶次生代谢相关产物的含量与土壤中3 种酶活性的相关性不显著。冯玄在研究次生代谢产物与土壤特征的相关性时也发现，鱼腥草次生代谢相关产物的含量与土壤中的酶活性相关性不显著。说明在高节竹和鱼腥草这2 种植物上，土壤酶活性不是活化土壤所吸收养分的主要因素[24]。但是，赵铖等研究表明土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性与青蒿素、青蒿酸含量呈显著或极显著正相关。提高土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性能够提高黄花蒿的青蒿素、青蒿酸含量[6]。说明不同植物的不同次生代谢产物对土壤相关酶降解的养分需求不同。

不同产地高节竹竹叶中次生代谢物的种类一致，且均为异荭草苷含量最高，但不同产地的含量差异明显。竹林土壤细菌数量与竹叶中荭草苷、对香豆酸和牡荆苷含量存在正相关关系，土壤真菌数量与竹叶中异荭草苷和木犀草苷含量存在显著正相关关系。综上所述，土壤微生物特征能够影响高节竹竹叶次生代谢产物的积累，但是不同次生代谢产物对土壤微生物特征的响应不同增加土壤细菌可以提高高节竹竹叶荭草苷、对香豆酸和牡荆苷含量，增加土壤真菌可以提高高节竹竹叶异荭草苷和木犀草苷。在实际生产中可以尝试调节土壤微生物特征来实现高节竹竹叶目标次生代谢成分的提高。