bFGF对大鼠急性脊髓损伤组织内质网应激（ERS）信号通路相关蛋白CHOP、Caspase12表达的影响

葛小刚　　蔡旗旗　　牟财国　　蔡杨阳

[摘要] 目的 探讨碱性成纤维细胞因子（bFGF）对大鼠急性脊髓损伤内质网应激（ERS）信号通路相关蛋白CHOP、Caspase12表达的影响。 方法 选取SD大鼠90只分为三组，每组各30只。Sham组为假手术组;SCI组采用HI-0400脊髓打击器制备急性脊髓损伤模型;bFGF组在SCI组基础上予bFGF蛛网膜下隙给药，评估损伤后不同时点后肢运动功能评分、脊髓细胞凋亡及脊髓组织CHOP、Caspase12表達情况。 结果 bFGF组损伤后21 d、28 d的BBB评分分别为（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI组，差异有统计学意义（t=7.533、9.963，P<0.05）。bFGF组损伤后1 d、3 d、7 d细胞凋亡分别为（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI组，差异有统计学意义（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05）。bFGF组CHOP及Caspase12表达分别为（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，显著低于SCI组，差异有统计学意义（t=12.348、8.653，P<0.05）。 结论 bFGF可通过抑制ERS相关蛋白CHOP、Caspase12的表达，对大鼠急性脊髓损伤起保护作用。

[关键词] 碱性成纤维细胞因子;内质网应激;大鼠急性脊髓损伤;保护作用;脊髓损伤评分;白细胞介素1-β转换酶家族12

[中图分类号] R363          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）11-0036-04

Effect of bFGF on the expression of proteins CHOP and Caspase12 related to endoplasmic reticulum stress（ERS） signaling pathway in acute spinal cord injury in rats

GE Xiaogang CAI Qiqi MOU Caiguo   CAI Yangyang

Department of Vascular Surgery， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou   318020， China

[Abstract] Objective To explore the effects of basic fibroblast growth factor（bFGF） on the expression of proteins CHOP and Caspase12 related to the endoplasmic reticulum stress（ERS） signaling pathway in acute spinal cord injury in rats. Methods A total of 90 SD rats were selected and divided into 3 groups， with 30 rats in each group. The sham group underwent the sham operation. The SCI group underwent the HI-0400 spinal cord percussion device to make acute spinal cord injury models. bFGF was administered to the subarachnoid space in the bFGF group on the basement of the SCI group. The hind legs motor function， spinal cord cell apoptosis and the expression of spinal cord tissue CHOP and Caspase12 at different times after injury were evaluated. Results The BBB scores of the bFGF group were （12.48±0.42） points and （13.53±0.47） points at 21 days and 28 days after injury， which were significantly higher than those in the SCI group， with statistical significance（t=7.533， 9.963; P<0.05）. The cell apoptosis in the bFGF group at 1 day， 3 days， and 7 days after injury was （7.13±0.45）%， （12.42±1.21）%， （10.31±1.27）%， respectively， which were lower than those of the SCI group， the differences were statistically significant（t=4.684， 8.945， 6.507; P<0.05）. The CHOP and Caspase12 expression in the bFGF group were （7.66±0.74） points and （7.52±0.87） points， respectively， which were significantly lower than those in the SCI group， with statistical significance（t=12.348， 8.653; P<0.05）. Conclusion bFGF can protect rats from acute spinal cord injury by inhibiting the expression of ERS-related proteins CHOP and Caspase12.

[Key words] Basic fibroblast growth factor; Endoplasmic reticulum stress; Acute spinal cord injury in rats; Protective effect; Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale; Cystein-asparate protease 12

作为临床常见的中枢神经系统创伤，脊髓损伤发病率、致残率高，且随着近年来交通及建筑业的不断发展，其发病率逐年攀升。脊髓损伤主要病理机制为原发性损伤后的继发性损伤，其中脊髓神经元凋亡在脊髓继发损伤中有重要作用[1]，且直接影响脊髓神经功能。最新研究结果显示，内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是细胞凋亡的又一途径，C/EBP同源性蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）是其特异性转录因子[2]。作为新型神经营养因子，碱性成纤维细胞因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）能够调节神经细胞生长及分化，通过外源性bFGF给药能够对脊髓损伤修复起促进作用[3]。目前，关于bFGF对ERS介导的细胞凋亡研究较少，本研究选择大鼠90只构建急性脊髓损伤模型，旨在分析bFGF通过ERS信号通路对大鼠急性脊髓损伤的早期保护作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

90只健康SD雌性大鼠购自上海市公共卫生临床中心[生产许可SCXK（沪）2020-0002]，体重210～240 g，平均（224±15）g;鼠龄6～9周，平均（7.31±0.33）周。bFGF购自北京同立海源生物科技有限公司，兔抗CHOP购自杭州联科美讯生物医药技术有限公司，TUNEL试剂盒购自艾美捷科技有限公司。严格按照医学实验动物护理及使用指南完成相关操作，本研究经实验动物管理审批，符合医学伦理标准。

1.2 方法

1.2.1 急性脊髓损伤模型制备  所有大鼠术前12 h禁食，按照40 mg/kg的剂量给予2%戊巴比妥钠麻醉，将T10棘突作为中心，充分暴露硬脊膜，选择背部正中位置行一3 cm的切口。制备大鼠急性脊髓损伤模型采用HI-0400脊髓打击器（北京友诚嘉业生物科技有限公司），将力度控制在200 kdyn/cm2。置入PE10导管（北京西美杰科技有限公司）至蛛网膜下隙，选择与脊髓损伤远端相距1 cm的位置，查看是否存在脑脊液流出，确认有，则采用1-0丝线（义乌市英明线业有限公司）缝合切口。在切口周围皮肤处放置导管，固定后进行打击处理，直至大鼠出现双下肢及尾部痉挛性抖动。损伤后补液采用生理盐水。按照200 kU/kg的剂量于大鼠腹腔给予青霉素钠（华北制药股份有限公司，国药准字H20013036）注射，预防感染。每天对大鼠进行2～3次膀胱按摩。

1.2.2 分组及给药  将90只大鼠随机分为三组，每组各30只，bFGF组予bFGF蛛网膜下隙给药，SCI组为急性脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）组，Sham组为假手术组。bFGF组损伤后采用IM-9B微量注射器[孚光精仪（中国）有限公司]经导管给予20 μL的bFGF，第1周1次/d，1周后每2周给药1次。SCI组在相同时点给予生理盐水注入，注入量同bFGF组。Sham组处理仅打开椎板，不进行脊髓打击。

1.2.3 脊髓标本采集  麻醉后，将大鼠放置于灌流池内，取仰卧位，以手术剪剪开大鼠胸腔，穿刺左心室，到达主动脉，予4%多聚甲醛（上海信帆生物科技有限公司）灌注固定，提取3 cm脊髓组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋后，切片厚度控制在5 μm。

1.3观察指标及评价标准

1.3.1 后肢运动功能评分  后肢运动功能采用大鼠脊髓损伤评分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）评估大鼠损伤后7 d、14 d、21 d及28 d的运动功能，早期后肢關节活动评分范围为0～7分，中后期主要评估后肢步态及协调功能，分值为8～13分，最后对大鼠爪子的精细活动予以评估，分值范围为14～21分。后肢运动功能完全正常计为21分[4-5]。

1.3.2 脊髓细胞凋亡  采用DNA断裂的原位末端标记[Terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]染色检测脊髓细胞凋亡，随机选择1 d、3 d、7 d各1张脊髓组织切片，按照试剂盒说明进行染色处理，并在Primovert光学显微镜（苏州长南精密技术有限公司）下对结果进行观察。染色处理后，胞核显示棕褐色表示阳性细胞，胞核显示蓝色表示非凋亡细胞。

1.3.3 脊髓组织CHOP、Caspase12表达  采集大鼠脊髓损伤的组织切片进行脱蜡、水化及氧化处理，然后进行抗原修复处理，依次加入兔抗CHOP IgG、抗兔生物素化二抗，分别进行辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）孵育、二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）显色处理，复染试剂选用苏木素。随机抽取5个视野的数据，将其平均值作为阳性细胞数。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，采用t检验;不符合正态分布的计量资料用M（QL，QU）表示，采用秩和检验;多组间比较采用F检验;计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组BBB评分比较

三组大鼠在不同时点的BBB评分比较，Sham组评分最高，与SCI组、bFGF组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;bFGF组损伤后21 d、28 d的BBB评分分别为（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI组，差异有统计学意义（t=7.533、9.963，P<0.05）。

2.2三组细胞凋亡比较

TUNEL染色结果显示，损伤后Sham组各时点均无明显细胞凋亡;损伤后SCI组1 d出现不同程度的细胞凋亡，且凋亡在损伤后3 d最为突出，7 d后逐渐下降。见封三图2。三组不同时点细胞凋亡比较，差异有统计学意义（P<0.05）;bFGF组损伤后1 d、3 d、7 d细胞凋亡分别为（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI组，差异有统计学意义（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05）;组内不同时点细胞凋亡趋势与TUNEL染色结果一致。

2.3 三组脊髓组织CHOP、Caspase12表达比较

损伤后7 d，Sham组CHOP、Caspase12表达均低于SCI组及bFGF组，差异有统计学意义（P<0.05）;bFGF组CHOP及Caspase12表达分别为（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，显著低于SCI组，差异有统计学意义（t=12.348、8.653，P<0.05）。见表3。SCI组CHOP、Caspase12阳性细胞均多于bFGF组，神经元存在脊髓灰质及白质表达，免疫染色显示棕褐色，细胞核也存在棕褐色。

3 讨论

有文献报道，脊髓损伤后神经功能会受到直接影响，具有较高的致残率与死亡率，其中细胞凋亡在继发性脊髓损伤机制中有重要作用[6]。临床强调，针对脊髓损伤应尽早选择合适的药物，积极抑制继发性凋亡，以实现疾病逆转。作为细胞凋亡的关键信号通路，ERS介导的凋亡通路对早期细胞凋亡能产生积极的影响[7]，其可激活未折叠蛋白反应，从而更好地适应各项应激反应，当其过度表达时，则会导致神经细胞凋亡。

作为脊髓损伤后常用的评估运动功能的方法，BBB评分能够相对准确、客观地反映后肢运动功能情况。本研究结果显示，bFGF组损伤后21 d、28 d的BBB评分分别为（12.48±0.42）分、（13.53±0.47）分，均高于SCI组，差异有统计学意义（t=7.533、9.963，P<0.05），提示大鼠脊髓损伤后多伴有严重的后肢瘫痪，予bFGF干预后，其脊髓损伤后后肢运动功能能够得到良好的恢复。bFGF组损伤后1 d、3 d、7 d细胞凋亡分别为（7.13±0.45）%、（12.42±1.21）%、（10.31±1.27）%，均低于SCI组，差异有统计学意义（t=4.684、8.945、6.507，P<0.05），提示bFGF可以通过促进局部内环境稳定而抑制细胞凋亡。且bFGF可以扩张血管或促使关闭的微血管开放，从而上调SCI部位血流量，改善其缺血缺氧情况;b FGF可以增强SCI后损伤区内皮细胞β1整合素表达，使内皮细胞的黏附、识别和迁移加强，从而促进血管形成。bFGF组CHOP及Caspase12表达分别为（7.66±0.74）分、（7.52±0.87）分，显著低于SCI组，差异有统计学意义（t=12.348、8.653，P<0.05）。作为转录因子家族C/EBP的成员，CHOP是ERS的特异转录因子[8-9]，当出现严重或持续性的ERS时，CHOP被激活。正常情况下，CHOP呈低表达，当受到ERS影响时，其呈现增高趋势，促使细胞凋亡[10]。既往研究结果显示，bFGF的生物学特性广泛，在神经细胞增殖、分化及凋亡中均有一定作用，目前被应用于神经损伤修复领域[11-13]，成为医学界研究的重点。白细胞介素1-β转换酶家族12（Cystein-asparate protease 12，Caspase 12）是一种组成性蛋白，位于内质网外膜，未被激活时主要以酶原形式存在，能够对ERS凋亡产生介导作用[14-16]。在ERS狀态下，Caspase12会被特定位点裂解激活，从而增加表达，并与细胞凋亡Caspase产生级联反应，诱导细胞凋亡。脊髓损伤后早期给予bFGF干预能够对细胞凋亡产生抑制作用，减轻细胞凋亡的程度。有学者认为，给予bFGF后，ERS途径被激活，导致神经元功能障碍，促使神经细胞凋亡[17-19]，此时CHOP在ERS凋亡进程中也有一定作用，CHOP表达被抑制，进而阻断或延缓凋亡的发生，实现脊髓损伤修复的目的[20]。但由于bFGF在ERS信号通路中对大鼠急性脊髓损伤的早期保护作用较为复杂，且本研究时间有限，未能对其他信号通路对大鼠急性脊髓损伤后的早期保护作用进行分析，存在一定的局限，在后续研究中应进一步进行试验验证，为临床提供依据。

综上所述，bFGF通过ERS信号通路能够抑制CHOP、Caspase12表达，发挥对大鼠急性脊髓损伤的早期保护作用，对于脊髓损伤的临床治疗及药物开发具有一定的参考价值。

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（收稿日期：2020-11-18）