CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在结直肠癌中的表达及意义

王月娇　　史学森　　白雪峰

[摘要] 目的 探討结直肠癌中CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达情况，并分析其相关性及临床病理学意义。 方法 收集2019年1—12月包头市肿瘤医院手术切除的结直肠癌肿物及癌旁5 cm、10 cm石蜡组织标本各41例，免疫组化法检测CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达水平，Sanger测序法检测微卫星不稳定性。 结果 结直肠癌癌组织CD4+T细胞表达阳性的细胞数为108.8个，高于癌旁5 cm的73.8个及癌旁10 cm的38.0个，差异有统计学意义（P<0.05）;癌组织CD8+T细胞表达阳性的细胞数为63.8个，高于癌旁5 cm的33.8个及癌旁10 cm的22.4个，差异有统计学意义（P<0.05）;癌组织PD-L1表达阳性的细胞数为18.0个，高于癌旁5 cm的3.2个及癌旁10 cm的1.2个，差异有统计学意义（P<0.05）。神经侵犯、脉管癌栓与结直肠癌癌组织CD4+T细胞表达相关，MSI、淋巴结转移、脉管癌栓与CD8+T细胞表达有关，MSI、淋巴结转移、神经侵犯、脉管癌栓与PD-L1的表达均无关。PD-L1和CD8+T细胞的表达呈低度正相关（r=0.350，P<0.05），PD-L1与CD4+T细胞表达无相关性（r=0.138，P>0.05）。 结论 CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在癌组织高表达，CD8+T与CD4+T细胞两者的高表达可作为预后良好的辅助判断指标，PD-L1与CD8+T细胞表达呈正相关。

[关键词] 结直肠癌;CD4+T细胞;CD8+T细胞;PD-L1;微卫星不稳定性

[中图分类号] R735.35          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2021）09-0152-04

The expression and significance of CD4+T， CD8+T cell and PD-L1 in colorectal cancer

WANG Yuejiao1   SHI Xuesen2   BAI Xuefeng3

1.Graduate School of Baotou Medical College， Baotou  014040， China; 2.Baotou Center for Disease Control and Prevention in Inner Mongolla Autonomous Region， Baotou  014030， China; 3.Department of Pathology， Baotou Cancer Hospital in Inner Mongolla Autonomous Region， Baotou  014030， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD4+T cells， CD8+T cells and PD-L1 in colorectal cancer， and to analyze their correlation and clinicopathological significance. Methods 41 cases of colorectal cancer tumors and paraffin tissue specimens 5 cm and 10 cm adjacent to the cancer were collected from Baotou Cancer Hospital from January to December 2019. The expression levels of CD4+T， CD8+T cells and PD-L1 were detected by immunohistochemistry， and the microsatellite instability was detected by sanger sequencing method. Results The number of CD4+T cells in colorectal cancer tissues was 108.8， which was higher than 73.8 cells in 5 cm adjacent to cancer and 38.0 cells in 10 cm adjacent to cancer， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of CD8+ T cells in cancer tissue was 63.8， which was higher than 33.8 in 5 cm and 22.4 in 10 cm adjacent to cancer（P<0.05）; The number of PD-L1 positive cells in cancer tissue was 18.0， which was higher than 3.2 in 5 cm and 1.2 in 10 cm adjacent to cancer（P<0.05）. MSI， lymph node metastasis and vascular tumor thrombus were related to the expression of CD8+T cells. MSI， lymph node metastasis， nerve invasion and vascular tumor thrombus were not related to the expression of PD-L1. There was a low positive correlation between the expression of PD-L1 and CD8+T cells（r=0.350， P<0.05）， but no correlation between the expression of PD-L1 and CD4+T cells（r=0.138， P>0.05）. Conclusion CD4+T cells， CD8+T cells， and PD-L1 are highly expressed in cancer tissues. The high expression of CD8+T cells and CD4+T cells can be used as auxiliary indicators for a good prognosis. The expression of PD-L1 is positively related to CD8+T cells.

[Key words] Colorectal cancer; CD4+T cells; CD8+T cells; PD-L1; Microsatellite instability

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率在所有恶性肿瘤中位居第三位[1]。近年来CRC的死亡率明显上升，因此深入研究并寻找新的治疗策略意义重大。肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是肿瘤细胞免疫的重要组分，CD8+T细胞是主要的抗肿瘤效应细胞，CD4+T细胞则促进其活化增殖，二者协同可对抗肿瘤。程序性死亡因子-1（Programmmed death-1，PD-1）/程序性死亡因子配体-1（Programmmed death ligand-1，PD-L1）属负性刺激分子，可诱导T细胞衰竭，促进肿瘤进展[2]。目前PD-L1的抗体阻断治疗已在微卫星不稳定（Microsatellite instability，MSI）型CRC中取得较为可观的疗效。但前期研究中PD-L1与CD4+T细胞、CD8+T细胞的关系分析却少有报道。本研究旨在检测CRC癌组织和癌旁组织中CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达水平，并分析其相关性及意义，为CRC的预后判断及免疫治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1—12月包头市肿瘤医院手术切除的CRC肿物及癌旁5 cm、10 cm石蜡组织标本各41例，均为首次切除，且无结直肠免疫相关病史，术前亦未行放化疗或生物免疫治疗。其中男34例，女7例，年龄46～79岁，平均（62.63±8.47）岁;结肠癌21例，直肠癌20例;脉管癌栓阳性19例，阴性22例;神經侵犯阳性17例，阴性24例;淋巴结转移阳性19例，阴性22例;MSI阳性7例，阴性34例。年龄、性别、肿瘤部位、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移资料从原病历中获取。本研究已通过包头市肿瘤医院医学伦理委员会批准，并签署知情同意书。

1.2 试剂

CD4兔单克隆抗体（克隆号SP35）、CD8兔单克隆抗体（克隆号SP16）、PD-L1兔单克隆抗体（克隆号MXR003）、免疫组化S-P法检测试剂盒、DAB试剂盒均购自福建迈新生物工程有限公司;石蜡包埋组织DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;MSI基因检测试剂盒购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法检测CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1 以切片的方式处理石蜡包埋组织，获得4.0 μm厚度的薄片，在载玻片上粘附后，置于65℃环境下持续2 h烘烤，再进行脱蜡，0.01 M EDTA（pH=9.0）高压修复2.5 min，自然冷却后，滴加0.3%的H2O2 10 min，一抗37℃孵育1 h，二抗室温孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，再经分色、返蓝、脱水、透明后封片，读片观察结果。

1.3.2 Sanger法检测MSI  将石蜡包埋组织切片置于1.5 mL无菌离心管中，提取基因组DNA，并检测浓度，然后稀释后进行Sanger法测序，分析结果。

1.4 结果判读

1.4.1 免疫组化结果判定标准  采用病理切片扫描仪扫描切片，NDP.View2软件观察，于低倍视野下选取5个阳性细胞数最多的区域，然后将视野放大30倍，计阳性细胞数，取平均值。当细胞膜被染成棕色时，CD4+T细胞、CD8+T细胞为阳性，细胞膜与细胞质或是两者之一呈现棕黄色时，PD-L1为阳性[3-4]。

1.4.2 判定MSI的标准  微卫星不稳定现象发生在两个或多个微卫星DNA标记位点上，称为MSI（+），只发生在一个或更少的位点上称为MSI（-）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，其中PD-L1在癌旁5 cm和10 cm处的表达数据不呈正态分布，CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达数据均显示方差不齐，因此三者表达及比较均选择非参数Kruskal-Wallis法，通过Bonferroni对组间两两比较进行校正，采用[M（Q1，Q3）]进行描述。相关性分析采用Pearson相关分析法。癌组织中三种标志物表达量与病理参数关系的分析采用二元Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在CRC癌组织、癌旁5 cm和10 cm的表达水平比较

CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在CRC癌组织和癌旁组织中均有表达。CD4+T细胞在癌组织中的表达水平高于癌旁组织，在癌旁5 cm的表达水平高于癌旁10 cm，差异有统计学意义（P<0.05）。CD8+T细胞和PD-L1在癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），而其在癌旁5 cm和癌旁10 cm的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 CRC癌组织CD4+、CD8+T细胞和PD-L1的表达与脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移及MSI的二元Logistic回归分析

CD4+T细胞在CRC癌组织中的表达与脉管癌栓和神经侵犯相关（P<0.05），与淋巴结转移和MSI无关（P>0.05）。CD8+T细胞的表达与脉管癌栓、淋巴结转移和MSI相关（P<0.05），与神经侵犯无关（P>0.05）。PD-L1的表达与脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移和MSI均无关（P>0.05）。

2.3 CRC癌组织内CD8+T细胞与CD4+T细胞两者和PD-L1表达间的相关性分析

通过Pearson分析发现，CRC癌组织内PD-L1与CD8+T细胞的表达呈低度正相关（r=0.350，P=0.025），与CD4+T细胞无相关性（r=0.138，P=0.390）。

3 讨论

TIL在肿瘤的发生及恶性进展中发挥了重要作用。在肿瘤发生初期，免疫系统可检测并清除已发生的肿瘤细胞，此为免疫清除阶段。该阶段既可使肿瘤细胞完全被清除，也可仅清除部分肿瘤细胞。在部分清除情况下，幸存的肿瘤细胞变体与宿主免疫系统将进入一种动态平衡。在平衡阶段，免疫系统对肿瘤细胞施加一种强有力的选择性压力，足以抑制但不能完全杀灭许多遗传不稳定且快速变异的癌细胞。在此选择期间，原肿瘤细胞的很多逃逸变种被破坏，出现新的变种，携带不同的突变基因，使它们的抗免疫攻击能力增强。总之，免疫系统未能完全清除肿瘤，却筛选出能抵抗免疫应答的肿瘤细胞，导致逃逸阶段的出现[5]。在癌症等慢性炎症部位T细胞长期激活会发生衰竭，衰竭的T细胞高水平表达受体PD-1。PD-L1与PD-1两者结合会在T细胞受体周围引起一系列的负性调节作用，有效防止T细胞活化，损害了T细胞的免疫功能，致使肿瘤发生免疫逃逸[6]。

本研究结果显示，CRC癌组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞和PD-L1的表达均显著高于癌旁5 cm及癌旁10 cm。周玮等[7]研究发现，在50例散发性结直肠癌中CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达率均较相应的癌旁组织高，Hua等[8]发现，PD-L1在正常大肠组织内无表达或低表达，在CRC癌组织中显著高表达，这与本研究结果类似。由此可见宿主确实对结直肠癌产生了免疫应答反应，使癌组织中的免疫效应细胞聚集增加。但结直肠癌的进展没有因为大量的淋巴细胞浸润而终止，其原因可能是肿瘤组织内高表达的PD-L1激活了PD-1/PD-L1通路，降低了T淋巴细胞活性，使癌细胞未能被完全清除而发生了逃逸。

目前针对各种T淋巴细胞亞型的研究发现，高度浸润的TIL可作为判断患者预后的重要指标。Taichi等[9]和Kuwahara等[10]的研究均证实CD4+T淋巴细胞的高表达与患者的良好预后相关，还有大量的研究证据显示，CD8+TIL的密度与不同类型癌症患者的长期生存均相关[11-12]，但目前国内外关于PD-L1在CRC中的表达与临床病理参数及预后的相关性报道尚无明确共识。本研究采用Logistic回归分析的方法得出，CRC癌组织中CD4+T细胞的浸润程度越高发生脉管癌栓和神经侵犯的风险越低;CD8+T细胞的表达量越多，发生脉管癌栓、淋巴结转移及微卫星不稳定性的概率也越低。脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移阴性均是预后良好的表现，且已有学者认为MSI状态下的CRC预后相对较好[13-14]，因此本研究结果与上述研究结果一致。

T淋巴细胞不仅可用来评估预后，还可利用其自身的免疫活性用于肿瘤的免疫治疗。以T细胞为基础的细胞免疫疗法，在恶性黑色素瘤、乳腺肿瘤及血液系统恶性肿瘤的治疗方面已取得了一定进展[15]。但是由于肿瘤微环境中的T细胞经常被抑制，导致肿瘤组织浸润T细胞数量少、活性低，严重影响治疗效果。抗PD-1/PD-L1单克隆抗体可有效抑制PD-1/PD-L1信号传导通路，其在多种实体肿瘤中的治疗效果已得到证实[16-18]。诸多研究证明，阻断PD-1或PD-L1等免疫检查位点能增加肿瘤部位的T细胞数量，提高T细胞的免疫杀伤功能[19]。因此T细胞免疫治疗与免疫检查位点阻断二者相结合，将有望提升肿瘤治疗效果，成为肿瘤治疗研究的新观点。本研究结果显示，CRC癌组织中PD-L1与CD8+T细胞的表达存在低度正相关，进一步证实了Sudoyo等[20]的观点，认为PD-L1在CRC中的表达主要是由于CD8+T淋巴细胞的浸润所致。这将为肿瘤免疫治疗策略提供重要的理论依据。

综上所述，TIL亚群CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在CRC癌组织中高度浸润。TIL有助于机体对抗肿瘤和提高预后，而PD-L1有可能影响TIL对肿瘤的杀伤作用，促使肿瘤发生免疫逃逸。因此，TIL细胞免疫治疗与PD-L1阻断剂结合有望开创肿瘤免疫治疗的新局面。PD-L1与CD8+T细胞的正相关性，也将为其提供理论支持。

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（收稿日期：2020-10-16）