基于毛丹状Au@Ag合金纳米结构的活性细菌表面增强拉曼散射传感

张 萌，陈东圳，宁 攀，任研伟，李 阳，张 亮

（1.西安交通大学第一附属医院，西安 710061；2.西安工程大学材料工程学院，纺织行业功能感知纤维及异形织造技术重点实验室，西安 710048；3.西安交通大学生命科学与技术学院，西安 710049）

表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是一种超灵敏的光谱分析技术［1］。该技术主要利用激光激发产生的局部表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）效应进行传感分析。该效应可以放大贵金属纳米结构表面的局部电磁场强度，极大地增强吸附或者靠近贵金属纳米结构表面靶标分子的拉曼信号，从而产生SERS指纹谱信号，并从SERS信号中获取分子的结构信息。SERS技术已被应用于各种生物分子、生物细胞的无损检测，灵敏度甚至可以达到单分子水平［2］。毫无疑问，SERS技术具有良好的传感灵敏度，在微生物细胞的检测中具有独到的优势。细菌是一种对人类社会产生巨大危害和影响的微生物，合理的研究利用SERS技术实现对活性细菌的快速和原位检测具有重要意义［3］。如评估抗生素的功效、对抗“超级细菌”感染或抗菌素耐药性等［4］。一般的SERS增强基底材料均具有较强的杀菌能力，而活性细菌的原位检测难度较大。

基于上述存在的问题，本研究团队前期开发了一种Ta原子掺杂的Ta@Ag多孔薄膜，Ta原子的掺杂有效抑制了Ag纳米结构的杀菌性能，提高了Ag纳米表面的生物相容性，实现了活性细菌的原位检测分析［5］。然而，由于Ta@Ag多孔薄膜是一种平面二维结构，当细菌吸附于薄膜表面时，Ta@Ag薄膜表面的光激发等离子体共振区域通常被细菌覆盖，获得稳定的SERS信号具有一定困难。此外，研究发现，“纳米间隙”和“纳米针尖”结构能极大放大局部电磁场强度，形成SERS“热点”区域，提高检测的灵敏度［6-8］。因此，等离子体“纳米间隙”和“纳米针尖”结构是一种极为有效的SERS增强基底［6-8］。研发具有较高SERS信号灵敏度、良好细菌细胞生物兼容性的等离子体贵金属纳米结构具有重要意义。

本论文通过使用无机的双氧水作为“清洁”还原剂，无机硝酸银作为反应调控剂，在低温下（10℃）进行各相异性生长，制备出一种毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒。首先，该纳米结构表面分布有致密的单晶“纳米针尖”，在适合波长的激发光激发下，可产生极强的LSPR效应，从而形成致密分布的SERS“热点”。其次，毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒具有较好的细菌生物兼容性，细菌吸附该纳米结构仍能保持良好的生物活性。最后，在细菌表面吸附毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒，并采用633 nm的激发光激发纳米结构表面的LSPR效应，进而实现细菌表面功能化学基团的原位检测。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

试验中所用到的主要化学药品均为分析纯，分别有硝酸银、双氧水、氯金酸等。试验中使用的主要设备有：玻璃反应瓶、 全自动数控干燥箱、分析天平、搅拌器、离心机、数控超声波清洗器等。采用的细菌是大肠杆菌（Esherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 试验方法

1.2.1 毛丹状Au@Ag合金纳米结构制备

将0.45 mL的HAuCl4水溶液（12.50 mol/L）加入烧瓶，加入10 mol/L 的硝酸银水溶液，紧接着加入90 μL的金种子溶液和30 μL的冰水。然后，将烧瓶放入10℃的水浴中，磁力搅拌（200 r/min）10 min，滴加碱性双氧水溶液还原HAuCl4。磁力搅拌反应10 min后，离心收集制备的纳米结构。

1.2.2 材料结构表征

采用场发射扫描电子显微镜（FEI Verios 460）和透射电子显微镜（JEM-200CX）进行表面结构形貌的表征；X射线能谱（energy dispersive X-ray spectrometer，EDS）分析采用能谱仪（EDS-OCTANE plus module）进行表征；紫外可见吸收光谱采用的光谱仪型号为Lambda 950；拉曼光谱采用激光拉曼光谱仪（HORIBA, LabRAM HR Evolution）进行表征分析。

1.2.3 毛丹状Au@Ag合金纳米结构细菌细胞相容性测试

细菌的生物活性采用平板计数法进行研究。将0.5 mL的原始浓度、二分之一浓度、四分之一浓度、八分之一浓度的毛丹状Au@Ag合金多级纳米颗粒溶液紫外照射60 min杀菌，然后分别与革兰氏阴性菌（大肠杆菌）液进行1∶1体积的混合，室温下作用3 h后取100 μL的大肠杆菌悬浮液涂布在LB固态培养基上，37℃培养箱培养16 h，通过菌落数量计算细菌的存活率。

1.2.4 SERS检测

首先，将毛丹状Au@Ag合金纳米结构与细菌细胞滴加混合；然后，将表面吸附有Au@Ag合金纳米结构的细菌滴加至硅片表面；最后，置于拉曼光谱仪信号采集平台进行检测，激发光波长选择633 nm，积分时间为1～15 s，激发光功率为1～5 mW。

2 结果与讨论

2.1 毛丹状Au@Ag合金纳米结构

采用湿化学还原反应法制备毛丹状Au@Ag合金多级纳米结构。如图1a所示，毛丹状Au@Ag合金多级纳米结构表面呈现出致密的纳米针尖结构（图1a），纳米颗粒平均直径约为80 nm，表面致密的纳米针尖分布清晰可见，其中大量分布的致密的纳米针尖可产生较高的纳米级粗糙度，致密的纳米针尖之间可形成大量的纳米间隙区域，该纳米间隙区域也可产生较大的比表面积，有利于提高单个毛丹状Au@Ag合金多级纳米结构对靶标分子的吸附能力。图1b为单个毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒表面局部放大的透射电子显微镜图像（transmission electron microscope image，TEM）形貌图，分析发现，每一个纳米针尖呈现出单晶结构。研究发现，“纳米间隙”和“纳米针尖”结构均为极好的SERS“热点”结构，吸附于该结构区域的靶标分子可产生明显的SERS信号［8-9］。然而，在常用的SERS检测中，制备 “纳米间隙”和“纳米针尖”表面结构具有较大困难［10］。水热反应或者湿化学合成工艺通常使用足量的表面活性剂分子和有机还原剂分子，这种吸附行为会产生阻挡效应，增加靶标分子吸附在“纳米间隙”或“纳米针尖”区域中的阻力，从而降低SERS信号的灵敏度［3，5-6，11］。因此，本研究采用碱性无机双氧水作为还原剂，并以无机硝酸银盐作为诱导剂，从源头避免引入任何表面活性剂和有机还原剂，最后制备出了毛丹状Au@Ag合金纳米结构。分析发现，毛丹状Au@Ag合金纳米结构生长过程分为两步：1）氯金酸、硝酸银还原产生的金、银原子沉积在金种子表面，并形成大量生长位点，较低的反应温度（10℃）导致较慢的反应速率［8，14-18］；2）还原产生的银原子通过欠电位沉积，选择性地吸附在不同晶面，这种对晶面的选择性吸附效应抑制了金原子在特定晶面的沉积，最终产生各向异性的生长［3，12-16］，并形成具有多针尖的毛丹状Au@Ag合金纳米结构（图1a、1b）。

图1 毛丹状Au@Ag合金纳米结构Fig.1 Rambutan-like Au@Ag alloy nanostructure

2.2 毛丹状Au@Ag合金纳米结构对细菌细胞的吸附及细菌兼容性

依据Song等［17］的报道 ，高表面粗糙度的花粉状纳米结构对细胞表面具有很强的黏附能力。毛丹状Au@Ag合金纳米结构具有多针状的表面结构和较高的纳米级表面粗糙度。因此，本研究分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与毛丹状Au@Ag合金纳米结构混合，然后观察毛丹状Au@Ag合金纳米结构在细菌表面的吸附能力。TEM表征发现，毛丹状Au@Ag合金纳米结构在细菌表面具有很强的吸附能力（图2）。因此，可有效利用毛丹状Au@Ag合金纳米结构进行细菌表面的SERS传感分析。

图2 细菌细胞吸附毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒Fig.2 Bacterial cell absorbed by rambutan-like Au@Ag alloy nanoparticles

此外，基于平板计数法，本研究进一步分析了毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒对细菌细胞的生物兼容性。不同浓度的毛丹状Au@Ag合金纳米结构作用于革兰氏阴性菌（大肠杆菌），孵育一定时间。然后，将大肠杆菌悬浮液接种在固体LB培养基上，37℃培养16 h，通过菌落数量观察细菌的存活数量。试验发现，毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒和大肠杆菌孵育作用后，大肠杆菌均能繁殖生长出较致密的菌落（图3），不同的存活率均在误差可接受的范围。由图3、4的数据可以进一步发现，毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒对于大肠杆菌具有较好的生物兼容性，毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒溶液与大肠杆菌孵育作用后，大肠杆菌仍能保持较高的生物活性。在大肠杆菌的兼容性试验中，Au@Ag合金纳米颗粒对其具有较好的兼容性。分析认为，本文制备的是一种Au@Ag合金纳米球，Au是人类发现的化学性能最稳定、生物相容性最好的金属元素之一，因此对不同的微生物细胞具备普遍适用的生物相容性。

图3 毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒细菌细胞生物兼容性测试Fig.3 Biocompatibility test of bacterial cell for rambutan-like Au@Ag alloy nanoparticles

2.3 毛丹状Au@Ag合金纳米结构LSPR性能分析

金、银纳米结构的光学性能受控于纳米结构的形貌。研究发现，纳米球、纳米棒、纳米立方体、纳米八面体、纳米十面体以及纳米二十面体等一系列不同的纳米结构具有不同的光学性能［18］。其中的分支状或者星形金、银纳米结构受到了研究人员的广泛关注。试验研究和理论计算分析表明，星形纳米结构的纳米针尖和纳米间隙能产生极强的局部电磁场强度放大，而与其相关的LSPR 带通常位于可见光到近红外光波长范围，使得该类纳米结构在SERS生物传感分析中具有极大优势。本研究提出的毛丹状Au@Ag合金纳米结构表面具有致密的纳米针尖结构。 因此，本研究采用紫外吸收可见光谱和时域有限差分法研究了毛丹状Au@Ag合金纳米结构的光学性能。

研究发现，制备的毛丹状Au@Ag合金纳米结构呈现出明显的LSPR特征峰及特殊的光学性能。图5a展示了毛丹状Au@Ag合金纳米结构的紫外可见吸收光谱，其吸收峰位于 630 nm 波长。这一波长与SERS检测中常用的633 nm的激发波长相匹配，因此可以产生表面增强共振拉曼散射，提高SERS分析的灵敏度。位于“纳米针尖”或者“纳米间隙”区域位置的电磁场强度的放大是产生拉曼增强的主要因素。为阐明毛丹状Au@Ag合金纳米结构与电磁场强度增强、激发光波长之间的对应关系，本研究模拟了毛丹状Au@Ag合金纳米结构在633 nm激发光激发下产生的局部电磁场强度分布。

首先， 本文根据毛丹状Au@Ag合金纳米结构的TEM，建立了毛丹状Au@Ag合金纳米结构的三维物理模型。其次，基于建立的物理模型，研究使用时域有限差分方法计算了633 nm激发光条件下Au@Ag合金纳米结构的表面电磁场强度分布。计算中入射光设定为x轴方向，电场方向对应为y轴方向，磁场方向对应为z轴方向，网格尺寸设定为2 nm，并假定计算模型悬浮于空气中（n=1.0）。计算中忽略纳米结构的化学增强效应以及银元素在金银合金中的影响。分析发现，在633 nm的激发光激发下，“纳米针尖”区域可产生较强的局部电磁场强度放大（图5b），且毛丹状Au@Ag合金纳米结构周围存在一定的非定域电磁场分布。这一分析结果支持采用633 nm的激发光进行后续的SERS传感。

图5 毛丹状Au@Ag合金纳米结构的局部表面等离子体共振性能Fig.5 Localized surface plasmon resonance property of rambutan-like Au@Ag alloy nanostructure

图4 毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒与大肠杆菌细胞作用后细菌的存活率Fig.4 The survival rate of Escherichia coli treated by rambutanlike Au@Ag alloy nanoparticles

2.4 SERS细菌检测

如图6所示，将表面吸附有毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒的大肠杆菌滴加至无菌的单晶硅片表面，然后置于拉曼检测平台进行检测。分析发现，在633 nm的激发光激发下，毛丹状Au@Ag合金纳米结构表面能够产生极强的LSPR效应。因此，本研究采用633 nm的激发光，检测由毛丹状Au@Ag合金纳米结构增强的细菌拉曼信号，测试的SERS光谱如图6c所示，具体的拉曼特征峰如表1所示。其中典型的拉曼位移位置为560 cm–1、772～910 cm–1、932 cm–1、1 102 cm–1、1 430 cm–1，这些拉曼特征峰位置分别代表糖类、核酸、蛋白质ν（C-C）及苯丙氨酸（蛋白质）、β-胡萝卜素及δ（CH2）。此外，使用1 430 cm–1拉曼位移处的特征峰对细菌表面进行成像（图6b），结果显示在局部区域呈现出较强的SERS信号，分析认为该区域应吸附有较为致密的毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒。

图6 SERS传感检测大肠杆菌Fig.6 SERS sensing of E.coli

表1 细菌的典型拉曼特征峰Tab.1 Typical Raman characteristic peaks of bacteria

本研究将毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒吸附于细菌表面，然后滴加于硅片表面进行细菌SERS信号的激发及收集。本研究设计的这种检测方法的优点主要如下：第一，构建的毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒具有较高的表面粗糙度和致密的纳米针尖结构，能在三维的细菌表面进行吸附［5］，且能保持较高的细菌生物活性；第二，构建的毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒在单颗粒表面具有大量的“纳米针尖”和“纳米间隙”，这种结构可产生较强的LSPR效应［3］；第三，将毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒吸附于细菌表面，可以有效地增强细菌表面的SERS信号，且制样简便，在实际检测中容易操作。

3 讨论

SERS作为一种检测细菌的热门技术，一直都是研究者所关注的焦点。在以往的研究中，多是研究如何增强拉曼散射强度，而忽略了大多基底材料具有的杀菌效果。本研究团队在之前的研究基础上，采用具有较好细菌细胞兼容性的Au@Ag合金纳米颗粒，同时也提出了利用毛胆状纳米结构来增强拉曼信号。首先，使用无机碱性双氧水作为“清洁”还原剂，还原制备了一种毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒，该制备方法能从源头避免有机还原剂、表面活性剂的引入，从而避免有机分子对SERS基底材料的不可逆吸附和污染。研究发现，毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒对细菌表面具有较强的吸附能力，且细菌能保持较高的生物活性，毛丹状Au@Ag合金纳米颗粒在单颗粒表面具有大量的“纳米针尖”和“纳米间隙”，这种结构可产生较强的LSPR效应。基于我们的细菌吸附试验，可以肯定的是，毛丹状Au@Ag合金纳米结构对革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）都具有很好的吸附效果。其主要原因是毛丹状Au@Ag合金纳米结构具有粗糙的表面结构，该结构表面存在类似于花粉颗粒的毛刺状物理结构，这样的物理结构必然具有很好的吸附挂载能力。一般情况下，该类结构不管是对细菌还是哺乳动物细胞，都具有良好的吸附能力。

本论文的研究，仅对大肠杆菌的生物兼容性进行了测试，测试发现毛丹状Au@Ag合金纳米结构对大肠杆菌的生物兼容性良好。Au单质是人类发现的化学性能最稳定、生物相容性最好的金属元素之一。Au@Ag合金纳米结构中Au是起主导作用的元素，目前大部分的等离子体生物检测都会用到Au纳米结构。利用以上特点，本研究检测了活性细菌的SERS指纹谱信号，表明了SERS分析方法能广泛应用于微生物细胞的检测分析。