通冠胶囊对ISO诱导大鼠心肌缺血的保护作用*

谭亚芳, 吴嘉妍, 祁建勇, 张敏州△

1广州中医药大学第二附属医院重症医学科(广东广州 510120); 2广州中医药大学(广东广州 510006)

缺血性心脏病又称冠状动脉心脏病，是心脏供血不足所引起的疾病。近年来，缺血性心脏病的发病率逐年上升，已成为危害人类健康和生命的一大类疾病[1-2]。大量实践证明，在心肌供血改善后，缺血受损的心肌功能不一定能够恢复，可逆性损伤却可能进一步加剧，出现如心律失常、心功能低下、出血性坏死、心脏衰竭加剧等情况[3-4]。如何有效地预防和减轻缺血损伤亟待解决。从中医学理论上讲，缺血性心脏病属于“胸痹”、心痛”、“厥心病”等范畴，是本虚标实所致，气虚为本，血瘀为标。通冠胶囊是根据邓铁涛教授学术思想和六十年的临证经验，针对气虚血瘀这一病机拟方而成，主要由黄芪、丹参、水蛭和冰片四味药物组成，四药合参,药简而力宏,共收益气活血、祛瘀通脉之功效[5]。临床研究表明，益气活血中药通冠胶囊具有改善冠心病介入治疗术后心肌缺血,改善术后心室重构及心功能,抑制术后再狭窄以及具有抗凝抗血小板等作用[6-9]。本课题组前期研究发现，通冠胶囊后适应对大鼠心肌缺血模型表现出呈剂量依赖性的保护作用[10]，通冠胶囊能够改善单个心肌细胞的收缩功能，减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤[11]，但具体的保护机制还有待进一步的研究，本研究起止时间为2018年1月至2020年3月。

1 材料与方法

1.1 实验药品 通冠胶囊主要由黄芪、丹参、水蛭、冰片等组成，由广东省中医院生产(批号:050802)。

1.2 实验动物 本次实验动物为体重(230±20)g清洁级雄性健康SD大鼠。所有动物实验及饲养方案均遵照中华人民共和国动物处理条例(卫生部，中华人民共和国，条例号：552001)，并且所有动物实验均在广东省中医院动物伦理委员会允许下进行。所有实验动物均购于广东省医学实验动物中心，经过严格及合格的检疫。

1.3 主要试剂及仪器 异丙肾上腺素(ISO)(SIGMA公司)、美托洛尔(SIGMA公司)、PD98059(Cell Signaling Technology公司)、LY294002(Cell Signaling Technology公司)、KN93(Cell Signaling Technology公司)、L-NAME(Cell Signaling Technology公司)。7180全自动生化分析仪、Cobas e601电化学发光分析仪。

1.4 方法

1.4.1 实验模型构建 根据实验要求，本实验采用ISO诱导大鼠急性心肌缺血方法。参考本实验室既往研究基础制定手术方案，分别采用10 mg/kg的ISO皮下注射10 d，85 mg/kg的ISO皮下注射2 d,观察对比两者的造模效果，选用85 mg/kg的ISO皮下注射2 d构建量效及机制实验中的模型。

1.4.2 实验动物分组及给药方法

1.4.2.1 现象实验 选取8～10周成年雄性SD大鼠50只，随机分为对照组(NE组)10只；低剂量模型组(ISO-L组，10 mg/kg)、高剂量模型组(ISO-H组，85 mg/kg)10只；通冠组(TGC组)10只；美托洛尔组(METO组)10只,给药方法见表1，ISO-L组连续给药10 d，其余组连续给药2 d。

表1 现象实验分组设置

1.4.2.2 量效实验 选取8～10周成年雄性SD大鼠80只，随机分为：对照组(NE组)10只，模型组(ISO组)10只，美托洛尔组(METO组)10只，10 mg TGC组10只，50 mg TGC组10只，100 mg TGC组10只，500 mg TGC组10只，1 000 mg TGC组10只；重复操作连续2 d。给药方法见表2。

表2 量效实验分组设置

1.4.2.3 机制实验 选取8～10周成年雄性SD大鼠60只，随机分为模型组(ISO组)10只；TGC组[上午按体重皮下注射85 mg/(kg·d)ISO溶液，至少2 h后按体重给予TGC溶液灌胃处理]10只；PD98059组(PD组，上午先按体重腹腔注射1 mg/kg PD98059混悬液，至少0.5 h后按体重皮下注射85 mg/kg ISO溶液，再隔至少2 h按体重给予EC50剂量TGC灌胃处理)10只；LY294002组(LY组)10只；KN93组(KN组)10只；L-NAME组10只。给药方法如表3所示。

表3 机制实验分组设置

1.4.3 检测指标

1.4.3.1 大鼠血液的心酶五项及肌钙蛋白(cTnT)指标 由广东省中医院大学城医院检验科收取样本，利用AST试剂盒、CK试剂盒、LDH试剂盒、CK-MB试剂盒、HBDH试剂盒、7180全自动生化分析仪检测血液心酶五项的指标。利用Troponin T hs STAT试剂盒、Cobas e601电化学发光分析仪检测血液cTnT的指标。

1.4.3.2 解剖大鼠取心、肺、肝、胫骨等组织重量及长度进行比较 解剖大鼠取心、肺、肝等组织，迅速称量，同时解剖胫骨，游标卡尺读出长度。以组织重量与胫骨长度做出比值。

2 结果

2.1 现象实验 各项指标均显示，ISO-L(10 d)或ISO-H(2 d)处理后均较NE组检测值高。心酶和cTnT检测值显示，ISO-H组心酶五项和cTnT的检测值均较ISO-L组高，本实验中使用85 mg/kg ISO连续皮下注射2 d为造模方法。心酶和cTnT检测值显示，TGC组和METO组心酶和cTnT的检测值均较ISO组低。心酶和cTnT检测值显示，TGC组和METO组数据基本持平。见表4、图1。

表4 现象实验心酶及肌钙数据表

注：与NE组比较 #P<0.01, ##P<0.001; 与ISO-H组比较*P<0.05, **P<0.001

2.2 量效实验 心酶五项和cTnT检测值显示，TGC给药后，心酶五项和cTnT的检测值均下降。量效曲线显示，TGC对大鼠心肌缺血的改善作用随药物浓度的增加呈先增加后减小趋势，其中最大斜率为3.602，EC50为38.94。心酶五项和cTnT检测值显示，当给予10 mg TGC时，心酶五项和肌钙数据较ISO组下降不大。心酶五项和cTnT检测值显示，当TGC剂量达到1 000 mg/kg时，心酶五项和cTnT的检测值均有所回升。心酶五项和cTnT检测值显示，以一定浓度梯度的TGC给药后，不同给药剂量时心酶五项和cTnT的下降幅度不同，其中100 mg/kg及500 mg/kg时下降幅度最大。见表5、图2。

表5 量效实验心酶及肌钙数据表

注：与ISO组比较 * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; 与NE组比较 #P<0.01, ##P<0001

2.3 机制实验 根据cTnT柱状图可知，PD组和LY组数据较ISO组明显降低且基本与空白对照组持平。而KN组、L-NAME组数据则明显上升且高于ISO组。心酶五项数据图显示，ERK通路和eNOS通路对TGC改善心肌缺血作用有影响且eNOS通路影响较ERK通路大，而AKT和CaMKⅡ通路对TGC影响较小。解剖学数据显示，给予TGC的各组数据均下降。根据解剖学数据显示，给予药物后肺胫比明显比肝胫比数据下降。解剖学数据显示，抑制剂组数据差别不大。见表6、图3。

表6 机制实验心酶及肌钙数据表

注：与TGC组比较 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

3 讨论

本实验通过设计两种大鼠心肌缺血造模方法，分别是连续10 d注射10 mg/kg(ISO-L组)和连续2 d注射85 mg/kg (ISO-H组)。通过测定心酶和肌钙数据最终确定采用连续2 d皮下注射85 mg/kg ISO的方法构建大鼠急性心肌缺血模型。建立缺血模型后通过TGC药物干预，同时与心肌缺血治疗药物METO作为对照药物进行对比。

在现象实验中，观察确定TGC其对大鼠急性心肌缺血有保护作用，通过血清学和解剖学各项指标均显示，ISO-L或ISO-H处理后均较NE组检测值高，说明ISO可导致大鼠心肌缺血损伤。心酶和cTnT检测值显示，ISO-H组心酶五项和cTnT的检测值均较ISO-L组高，说明85 mg/kg ISO连续皮下注射2 d导致心肌损伤程度更高、心酶和cTnT检测值显示，TGC组和METO组心酶和cTnT的检测值均较ISO组低，说明TGC和METO均对大鼠急性心肌缺血有改善作用。心酶和cTnT检测值显示，TGC组和METO组数据基本持平，说明1 g/kg TGC与10 mg/kg美托洛尔改善心肌缺血作用相似。证明了TGC对大鼠的心肌缺血具改善作用，并呈一定的剂量效应关系，且其改善心肌缺血作用优于METO。

在确定TGC的保护作用后进行量效实验，通过设计5个浓度药物梯度，观察药物的最有效剂量。在量效实验中，心酶五项和cTnT检测值显示，TGC给药后，心酶五项和cTnT的检测值均下降，再次证明TGC对大鼠急性心肌缺血有改善作用。量效曲线显示，TGC对大鼠心肌缺血的改善作用随药物浓度的增加呈先增加后减小趋势，其中最大斜率为3.602，EC50为38.94。心酶五项和cTnT检测值显示，当给予10 mg TGC时，心酶五项和肌钙数据较ISO组下降不大，推测小剂量TGC对大鼠心肌缺血损伤的修复作用不明显。心酶五项和cTnT检测值显示，当TGC剂量达到1 000 mg/kg时，心酶五项和cTnT的检测值均有所回升，猜测在TGC治疗大鼠急性心肌缺血时使用过高剂量对心肌损伤的修复作用不明显或开始出现毒性不良反应。心酶五项和cTnT检测值显示，以一定浓度梯度的TGC给药后，不同给药剂量时心酶五项和cTnT的下降幅度不同，其中100 mg/kg及500 mg/kg时下降幅度最大，猜测当给药剂量于100～500 mg/kg时TGC改善大鼠急性心肌缺血效果较好。

根据量效实验结果得出的EC50进行机制实验，以给药组作对照组，实验组则给予EC50浓度的药物后注射相关通路的抑制剂，通过解剖学和血清学观察探索其可能的作用机制。在机制实验中，心酶五项和cTnT数据充分说明了TGC对ISO造成的大鼠心肌缺血有明显改善作用。根据cTnT柱状图可知，PD组和LY组数据较ISO组明显降低且基本与空白对照组持平，这一结果说明ERK1/2、AKT通路对TGC的改善作用影响不大。而KN组、L-NAME组数据则明显上升且高于ISO组，推测KN和L-NAME对TGC对大鼠心肌缺血的改善作用有抑制效果且可能对心肌缺血有一定损伤作用，其作用可与ISO造成的心肌缺血作用叠加。心酶五项结果显示，ERK通路和ENOS通路对通冠胶囊改善心肌缺血作用有影响且ENOS通路影响较ERK通路大，而AKT和CaMKⅡ通路对TGC影响较小。推测TGC对大鼠心肌缺血的改善作用主要与eNOS通路有关。解剖学结果显示，给予通冠胶囊的各组数据均下降，再次验证了TGC对大鼠心肌缺血有改善作用。根据解剖学数据显示，给予药物后肺胫比比肝胫比数据下降明显，推测药物改善右心缺血优于改善左心缺血。解剖学数据显示，抑制剂组数据差别不大，无法通过解剖学确定TGC对心肌缺血改善作用的机制。本实验用4种通路抑制剂阻断对应通路，结果表明，eNOS抑制剂L-NAME处理后肌钙心酶等指标均有明显上升。本实验提出通冠胶囊对大鼠急性心肌缺血的保护作用的主要通路可能为eNOS通路，ERK1/2和CaMKⅡ通路对TGC改善作用也有一定影响，但仍需从分子生物学及基因学方面进一步明确机制。

此次实验初步研究了TGC对心肌缺血改善作用的量效和机制，但还存在很多不足之处。第一，量效实验设计的5个浓度梯度范围较大，可在此实验基础上进一步缩小浓度范围，更好地探索药物最有效剂量；第二，关于改善心肌缺血通路的文献较少，并没有过多数据支持所设计的抑制剂浓度为该抑制剂的最有效给予浓度；第三，由于改善心肌缺血通路的文献较少，设计的通路除eNOS通路外其他通路结果不太理想，可在此基础上进一步进行其他探索；第四，此次实验全部为大鼠药理实验，下一步探索可设计分子蛋白实验进一步明确TGC的作用。