内生真菌对硝酸钙胁迫下番茄种子萌发的影响

叶 鑫王 娜牛世伟张 鑫

(辽宁省农业科学院植物营养与环境资源研究所,辽宁 沈阳 110161)

番茄是世界上第二大蔬菜作物[1]。设施栽培增加了淡季番茄供应量,是有效提高单位面积产值的重要生产方式。由于设施栽培化肥投入过量以及缺少自然淋溶等原因致使土壤次生盐渍化问题日益严重[2],特别是硝态氮大量积累,引起土壤酸化,养分失衡,部分营养物质无法被作物吸收,土壤板结,耕层变浅,通气透水性差,直接危害作物的正常生长[3～5]。设施土壤次生盐渍化已成为设施蔬菜产业发展的瓶颈,因此解决设施土壤次生盐渍化问题,已成为当务之急。

人们尝试了各种治理设施土壤次生盐渍化问题的途径,主要包括生物措施、农艺措施和工程措施等,而这些措施耗时较长、成本较高。植物内生菌作为一种微生物资源,它与植物的关系是互惠共生的,植物为内生菌提供能量和营养[6];内生菌及代谢物能促进植物生长发育和提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。沈德龙等研究表明水稻内生成团泛菌(Pantoea agglomerans)YS19 能分泌4 种不同的植物生长激素,它们共同调节水稻生命活动,影响水稻乳熟期光合产物的分布[7]。有研究表明,碱胁迫可使强耐碱禾本科植物小花碱茅幼苗体内88 种代谢物水平显著变化,但接种丛枝菌根(AM)真菌后只有31 种组分有变化,显示逆境下AM 可协助宿主稳定体内代谢,提高宿主抗逆性[8]。目前,关于植物内生菌研究主要集中在促进作物生长等方面,而关于提高作物抗逆方面相关研究较少,尤其提高番茄适应次生盐渍化相关研究甚少。为此,本研究从多年连作的设施番茄植株中分离内生真菌并用发酵液处理番茄种子,在盐胁迫下进行发芽试验,以筛选出能促进种子萌发的内生真菌,为提高番茄适应土壤次生盐渍化和设施生产的可持续发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 采集样品 设施番茄植株和根际土壤样品采自于多年连作的常规番茄种植区和碱地番茄种植区,将采集的样品装入自封袋,并立刻放到冰盒中,迅速带回实验室,4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 供试培养基 PDA 土豆液体培养基:土豆洗净去皮,切成小方块状,取土豆块200 g,加入适量水,加热,沸腾后继续煮约30 min,八层纱布过滤。取土豆滤液,葡萄糖20 g,盐30 g,定容至1 000 ml,pH 自然,分装灭菌(固体培养基需加1.2%琼脂粉)[9]。

孟加拉红液体培养基:蛋白胨5 g,磷酸二氯钾1 g,硫酸镁0.5 g,葡萄糖10 g,氯霉素0.1 g,孟加拉红0.033 g,蒸馏水1 000 ml,加热沸腾溶解,分装灭菌(固体培养基需加1.2%琼脂粉)[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 植株样品表面消毒 取番茄根、茎、叶样品,用自来水清洗干净。用流水冲洗样品1 h 后,分别称取根、茎、叶样品0.1 g,置于5%次氯酸钠中清洗5 min,用无菌水清洗3 遍,再置于75%乙醇消毒30 s,再用无菌水清洗3 遍,将冲洗根、茎、叶的无菌水涂布于PDA 培养基平板上,置于28 ℃培养箱中暗培养,观察平板中菌落的生长情况,若无菌落长出,则说明消毒完全[10]。

1.2.2 真菌分离与纯化

1.2.2.1 植株内生真菌分离与纯化 将消毒后的番茄根、茎、叶样品放入无菌研钵中,加入少量无菌石英砂和0.9 ml 无菌水。研磨后的混合液用无菌水稀释10-1至10-6浓度,取0.1 ml 稀释液均匀涂布于孟加拉红培养基平板上,28 ℃培养,每个处理3 次重复。采用平板划线分离法将新长出的菌落转接到新的孟加拉红培养基平板上,直至获得单菌落。菌种可选择短期斜面保存和长期甘油保存[11]。

1.2.2.2 根际土壤真菌分离与纯化 在无菌操作台中,将少量根际土壤样品放置于无菌培养皿中,加入1 ml 无菌水搅拌均匀,取0.1 ml 土壤浑浊液用无菌水分别稀释10-1至10-6浓度,再取0.1 ml 土壤稀释液均匀涂布于孟加拉红培养基平板上,28 ℃培养,每个处理3 次重复。采用平板划线分离法将新长出的菌落转接到新的孟加拉红培养基平板上,直至获得单菌落。

1.2.3 真菌发酵液制备 无菌条件下,将供试菌株分别接种于PDA 液体培养基中,28 ℃,200 r/min 培养5 d,离心取上清,并配置发酵液浓度为1 mmol/L,备用。

1.2.4 硝酸盐胁迫浓度筛选 选取饱满、整齐一致的番茄种子在穴盘中育苗。待苗长至4～5 叶龄时,选取生长一致的健壮幼苗,每2 d 分别浇50 ml 的0、15、30、45、60、75、90、120 mmol/L 浓度的Ca(NO3)2,以浇清水为对照。每个处理10 穴,3 次重复,随机排列。观察植株长势情况,15 d 后测定其相关指标。

1.2.5 真菌发酵液筛选 番茄种子用2%次氯酸钠溶液,浸泡15 min,然后将种子用去离子水清洗干净,发酵液拌种,对照用同等体积水处理。处理后的种子晾干后,放入装有两层滤纸的培养皿中,加入10 ml 的Ca(NO3)2溶液,25 ℃催芽,统计种子发芽数至14 d。

2 结果与分析

2.1 真菌分离情况

从表1 可以看出,从番茄植株的根、茎和叶片中,分离纯化出16 株植物内生真菌,其中常规番茄种植区分离出9 株,较碱地番茄种植区多28.6%;从根际土壤中分离纯化出54 株真菌,其中常规番茄种植区分离出40 株,是碱地番茄种植区近3 倍。由此可见,常规番茄种植区的植物和土壤样品中获得真菌数量均高于碱地番茄种植区,且根际土壤真菌数量多于植物内生真菌数量。

表1 真菌分离情况

2.2 不同浓度硝酸钙胁迫对番茄生长的影响

2.2.1 不同浓度硝酸钙胁迫对番茄长势的影响 从图1可以看出,15 mmol/L 硝酸钙胁迫下,番茄植株长势较好,叶片呈深绿色,而对照植株叶片呈浅绿色。30、45、60 mmol/L 硝酸钙胁迫下,叶片呈深绿色,但生长相对缓慢。75 mmol/L 硝酸钙胁迫,部分叶片枯萎,且生长相对缓慢。90、120 mmol/L 硝酸钙胁迫下,叶片和根系严重枯萎,甚至死亡。可见,用高于75 mmol/L 浓度的硝酸钙胁迫,番茄植株将无法正常生长。

2.2.2 不同浓度硝酸钙胁迫对番茄生长的影响 从图2可以看出,用不同浓度硝酸钙处理番茄植株,硝酸钙浓度越大,植株生长越缓慢,其中120 mmol/L 硝酸钙胁迫下,植株明显受抑制生长,长期胁迫甚至导致植株死亡。而用15 mmol/L 硝酸钙处理番茄植株后,株高、苗鲜重、苗干较对照低5.10%、10.99%、2.29%,根长、根鲜重、根干较对照低9.57%、24.06%、13.42%,硝酸钙对番茄植株地上部分影响相对较小,而对地下部分影响相对较大,说明硝酸钙胁迫使根系受损,进而影响植株养分吸收。75 mmol/L 硝酸钙胁迫下,株高、苗鲜重、苗干较对照低36.73%、55.39%、38.71%,根长、根鲜重、根干较对照低28.14%、66.87%、52.85%,硝酸钙其对番茄植株地上部分和地下部分影响均较大,但短期胁迫不会导致植株死亡。因此,可选择75 mmol/L 硝酸钙作为番茄植株生长的胁迫环境。

2.3 不同真菌发酵液对硝酸钙胁迫下番茄种子萌发的影响

从图3 可以看出,75 mmol/L 硝酸钙胁迫下,16 种真菌发酵液对番茄种子发芽影响差异较大。与对照相比,DL3、DL12、XN11 促进了番茄种子萌发,发芽率分别高于对照25.73%、29.01%和9.67%,其中DL12 促生效果最好,缓解了盐碱对种子萌发的抑制作用,而其他真菌发酵液对种子发芽没有促生作用。

图1 不同浓度硝酸钙胁迫下番茄长势

图2 不同浓度硝酸钙胁迫对番茄生长的影响

图3 不同真菌发酵液对硝酸钙胁迫下番茄种子萌发的影响

3 讨论与结论

植物内生菌已逐步成为生命科学领域的研究热点,受到国内外专家的关注。已有研究证实,内生菌在植物体内不仅积极地生存着,而且还能产生多种生物学作用。植物—内生菌和谐共生、互利共栖的生命形式,可能是未来生态型农业发展的一条重要思路[12～14]。设施土壤次生盐渍化现已成为设施蔬菜常见问题。植物内生菌通过调节植株生长发育能力,提高对土壤中营养的吸收,提高植株的抗逆性,不仅能够增产增收,还可提高肥料利用率,有效降低养分流失对环境的污染。本研究从次生盐渍化的设施番茄根茎叶和根际土壤中分离真菌,并用发酵液处理番茄,以促进番茄生长,降低盐碱对番茄的伤害。结果表明,盐碱胁迫环境下,从植株和根际土壤中获得的真菌数量较少,其中植物内生真菌分离出16 株,根际土壤真菌分离出54 株。通过不同浓度硝酸钙胁迫对番茄生长的影响,筛选出75 mmol/L 硝酸钙为最佳胁迫浓度。在75 mmol/L 硝酸钙胁迫下,用不同真菌发酵液处理番茄种子,结果发现DL12 内生真菌发酵液可促进番茄种子发芽,缓解盐胁迫对种植萌发的毒害作用,为设施生产修复土壤次生盐渍化深入研究奠定基础。