肺腺癌中核黄素转运体2基因和蛋白表达及功能的生物信息学分析

贾春丽，路鹏霏，邱萍，沙娅·马哈提，杨颖，包永星，张华

原发性肺癌的发病率和病死率在世界范围内居于首位，其中非小细胞肺癌约占85%，以肺腺癌为主。据估计仅在2018年全球新增肺癌患者达209万，而肺癌所造成的死亡人数占癌症相关死亡人数的近20%。尽管新生物标志物和治疗方法的发现对肺癌诊疗做出了巨大贡献，但由于肺癌的生物学复杂性和不良预后，肺癌患者生存率仍然很低[1-2]。因此寻找新的肺癌治疗干预靶点尤为重要。

核黄素转运体2(riboflavin transporter 2，RFT2)，是一种跨膜蛋白，又名hRFT2、SLC52A3、C20orf54，是核黄素转运蛋白家族中的重要一员，其作用主要是进行核黄素转运。有研究证明，核黄素的缺失与肿瘤的发生及发展具有密切的关系，人类及其他哺乳动物所需核黄素由饮食获得或肠道微生物合成[3]，RFT2在核黄素吸收及调节核黄素组织分布过程中发挥的作用尤为重要。其在肺腺癌发生发展中的作用尚不十分清楚，本研究拟利用肿瘤公共数据库中该基因的相关信息，探究该基因在肺腺癌中的表达以及在发生、发展、预后中的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 RFT2 mRNA 在肺腺癌中的表达及患者生存状况分析 在GEPIA 数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)中输入RFT2,在样本数据库中选择肺腺癌,分析RFT2在肺腺癌组织、癌旁组织及不同临床分期肺腺癌组织中的表达水平。进一步分析其与肺腺癌患者总生存时间(overall survival，OS) 及无病进展生存时间(disease free survival，DFS)的关系。以RFT2表达水平的中位数为标准,分为高表达组和低表达组,对样本中肺腺癌患者进行生存分析。

1.2 RFT2在肺腺癌组织和正常肺组织中蛋白水平的表达 The Human Protein Atlas数据库(http://www.proteinatlas.org)是基于特制的抗体，并用免疫组化染色技术展示蛋白在组织中的表达，可用于正常组织和肿瘤组织蛋白差异表达分析。本研究中，引用网站中ABAT免疫组化抗体(No.HPA049391)对正常肺组织和肺腺癌的免疫组化实验，分析RFT2在肺腺癌与正常肺组织中的蛋白表达差异。

1.3 RFT2蛋白相互作用网络及功能分析 String数据库(http//string-db.org/)是用于探究蛋白质之间相互作用网络的工具，其包含经研究证实和可以预测的蛋白质—蛋白质相互作用网络及生物数据库。本研究中输入“RFT2”，物种类型选择“Homo sapiens”，选择检索结果中排名前10的蛋白。利用WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)进行功能富集分析，将与RFT2相互作用的关键基因利用WebGestalt分析，了解其参与的细胞组分、生物过程、生物功能。

1.4 统计学方法 应用统计软件进行统计学分析。采用t检验计算肺腺癌组织和正常肺组织中RFT2的表达差异；利用F检验分析不同期别肺腺癌RFT2的表达；采用Kaplan-Meier法计算RFT2表达与预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺腺癌组织和正常肺组织及不同期别肺腺癌组织中RFT2 mRNA表达比较 GEPIA数据库中收集了483例肺腺癌组织样本(其中Ⅰ期258例，Ⅱ期117例，Ⅲ期80例，Ⅳ期28例)和347例正常肺组织标本，分析发现肺腺癌组织中RFT2 mRNA表达水平显著高于正常肺组织(P<0.01)，见图1。进一步分析不同期别肺腺癌组织中该基因的表达，发现Ⅰ～Ⅳ期肺腺癌组织中该基因表达差异无统计学意义(F=0.065,P=0.987)，见图2。

2.2 肺腺癌中RFT2 mRNA表达与患者预后的关系 利用GEPIA数据中肺腺癌患者的生存数据进一步分析，以RFT2 mRNA表达的中位数为标准，将肺腺癌患者分为RFT2 mRNA高表达组和低表达组，与低表达组比较，RFT2 mRNA高表达患者OS明显缩短(HR=1.4，P=0.034),而DFS比较差异无统计学意义(HR=1，P=0.890，见图3、4。

图3 RFT2 mRNA表达与肺腺癌患者OS的关系

图4 RFT2 mRNA表达与肺腺癌患者DFS的关系

2.3 肺腺癌组织和正常肺组织RFT2蛋白表达水平比较 利用The Human Protein Atlas数据库分析肺腺癌组织和正常肺组织的免疫组化结果。RFT2蛋白主要定位于细胞膜和细胞质，染色呈棕黄色。在正常肺组织中阳性细胞较少、染色相对较浅；而在肺腺癌组织中，阳性细胞明显增多，RFT2蛋白染色较深，RFT2蛋白呈高表达，见图5。

图5 肺腺癌组织和正常肺组织RFT2蛋白表达情况

2.4 RFT2的生物信息学分析 在String数据库中对与RFT2相关联的蛋白进行生物信息学分析，发现了10个与RFT2在功能及定位上相关的蛋白，包括ATP8A2、DLEC1、FLAD1、PLCE1、RAB37、RDH5、RFK、SLC35G2、TMEM173、ATP1B2(图6)，利用WebGestalt进一步对这些蛋白分析发现，这些蛋白主要构成细胞膜、内膜系统、高尔基体、细胞质等细胞结构。参与生物调节、代谢、细胞应激反应等过程，发挥结合离子、结合蛋白质、结合核酸等功能，见图7。

图7 RFT2及其相关联蛋白参与的生物学过程、细胞组分、分子功能分析

注：DLEC1.肺癌和食管癌缺失基因1；PLCE1.磷脂酶Cε1；FLAD1.黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶1；RDH5.视黄醇脱氢酶5；SLC35G2.溶质载体家族35成员G2；RFK核.黄素激酶；TMEM173.跨膜蛋白173；ATP1B2.K+-ATP酶β2亚基；RAB37.RAS癌基因家族成员RAB37；ATP8A2.ATP酶氨基磷脂转运体Ⅰ类8A型成员2

3 讨 论

核黄素(维生素B2)是B族维生素的重要组成部分，它组成人体中重要的黄素辅酶，如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)的核心部分。在正常的生命活动中，核黄素通过FAD和FMN 2种物质形式来间接参与机体内氧化和还原反应，是许多氧化还原酶的关键组分，对机体正常的生命活动必不可少，同时核黄素也通过参与线粒体呼吸链运转影响ATP的产生[4]。核黄素发挥上述功能与细胞的能量代谢、维持细胞稳态紧密相关，间接影响体内各种各样的生命活动过程[5]。

核黄素转运蛋白家族主要发挥生物体跨膜吸收核黄素载体的作用。RFT2基因编码的蛋白产物有469个氨基酸、11个跨膜结构域[6]。该基因最早由Yamamoto于2009年鉴定出来，后续研究表明其能特异高效地转运核黄素，且在目前已知的核黄素转运体家族中效率最高[7]。RFT2作为人核黄素转运蛋白家族的一员，主要功能是转运核黄素[8-9]。

大规模食管癌全基因组关联分析证实，RFT2是食管鳞状细胞癌(ESCC)的易感基因[10]。在食管鳞状细胞癌中，RFT2扮演着易感基因与致病基因双重角色，它能维持核黄素的内稳态和代谢过程，从而使肿瘤细胞能够快速增殖的同时减少细胞凋亡，这一过程在食管癌的发展中尤为重要。RFT2过表达可促进癌细胞增殖及对顺铂的耐药过程，RFT2基因多态性与鼻咽癌易感性相关[11-13]。体外研究证实，在胃癌细胞中过表达RFT2可促进胃癌细胞增殖、集落形成，增强胃癌细胞迁移和侵袭能力[14]。

传统的实验研究方式只能实现对少数基因的研究，研究成果有限。随着研究技术的不断发展，尤其是测序技术的不断改进升级，基因组学及蛋白质组学的大规模应用，研究结果的产出呈指数级增长。而公共数据库则整合了多个研究成果，采用目前的生物信息分析技术对公共数据库中海量信息进行整合分析，更有助于从多个维度探究基因与疾病的关系，进一步了解疾病的发生发展机制，寻找有效的疾病诊断及治疗靶点，挖掘疾病的致病机制。本研究借助公共数据库中TCGA平台的肺腺癌相关数据及蛋白组学数据，探究了RFT2在肺腺癌中表达特点、对预后影响的及在肺腺癌中发挥的作用。

本研究结果显示，RFT2 mRNA在肺腺癌组织中明显高于癌旁组织，在RFT2蛋白水平亦观察到同样的结果。人类蛋白质图谱(The Human Protein Atlas)提供人类蛋白在组织和细胞中的分布，该数据库中免疫组化结果提示，RFT2蛋白在肺腺癌组织及细胞中主要位于细胞的胞膜及胞质，利用String数据分析提示，其相关蛋白主要构成细胞膜、内膜系统、高尔基体、细胞质等细胞结构，与免疫组化结果一致，在不同期别的肺腺癌组织中该基因的表达无明显差异。Fu等[15]发现，相对于正常大脑组织，RFT2在胶质瘤中表达水平显著上升，在胶质瘤细胞中RFT2沉默促进细胞凋亡和抑制细胞周期，使胶质瘤细胞增殖能力受到抑制。另外，RFT2对宫颈癌的发生发展也有影响，有研究显示[16]，相对于正常宫颈组织，RFT2的mRNA和蛋白水平在宫颈癌组织中均明显上调，并且RFT2与肿瘤分期明显相关。Jiang等[11]研究发现，RFT2在食管癌组织和食管癌细胞中均明显高表达，上述研究中RFT2蛋白表达状况与本研究肺腺癌中该基因的表达一致。

进一步利用GEPIA数据分析肺腺癌患者的预后，RFT2高表达的肺腺癌患者OS缩短，对患者的DFS无影响，RFT2高表达提示肺腺癌患者预后差。在对食管鳞癌患者的研究中发现，细胞质中RFT2蛋白高表达患者预后差，是食管鳞癌不良预后的标志物[10]。推测可能是高表达RFT2通过维持核黄素稳态和增强细胞能量代谢从而支持肿瘤细胞的快速生长、分裂及避免能量耗竭导致的细胞损伤，使肿瘤细胞能在恶劣营养环境中存活并使成瘤性增强, RFT2蛋白高表达的肿瘤恶性程度更高，导致患者预后差。String及WebGestalt数据库对RFT2及相关蛋白分析显示，这些蛋白主要位于细胞膜、内膜系统、高尔基体等膜性结构中，参与细胞生物代谢过程，在结合蛋白、离子等过程中发挥着重要作用，但其具体功能有待进一步验证。

综上所述，利用肿瘤数据库分析提示RFT2在肺腺癌中呈高表达，且与患者不良预后相关，参与了细胞多种生物过程，有可能成为肺癌治疗的干预新靶点，但其在肺腺癌发生发展中的具体功能有待进一步体内外实验探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

贾春丽：课题设计，论文撰写；路鹏霏：数据获取；邱萍、杨颖： 参与论文撰写；沙娅·马哈提：统计分析；包永星：研究构思，论文终审；张华：课题设计；论文修改