miR-103、OLFM4 mRNA在前列腺癌组织中的表达及其临床意义

鲍文澜，朱传营，张林，刘海龙，郑磊贞

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是最常见的男性恶性肿瘤之一，约占男性恶性肿瘤的19%，也是癌症相关死亡常见的原因之一，发病率极高，常伴有远处转移[1-2]。骨骼是其最常见的转移部位，可引发骨痛、骨折和神经压迫，极大降低患者的生活质量[3]。因此需要了解PCa的详细作用机制，以期找到有效疗法[4]。微小RNA(miRNA)是一种非编码单链小RNA，可在转录水平调节细胞的生长、凋亡和迁移[5]。大量研究已证实癌细胞的正常调节机制可被miRNA的异常表达干扰，并且已有多种miRNA被作为PCa诊断、治疗和预后的生物标志物[6]。而最近有研究发现，miR-103可通过调控程序性细胞死亡因子10(PDCD10)在PCa发生机制中起重要作用[7]。嗅觉介导素4(OLFM4)通常在特定组织中表达，可调节细胞生长和凋亡等重要的细胞过程，并且OLFM4在不同肿瘤阶段和癌组织的发生发展中具有独特的调节作用，如在胰腺癌中其表达上调，而在PCa中则表达下调[8-9]。但目前还未发现关于miR-103和OLFM4在PCa临床中的研究，现检测miR-103、OLFM4信使核糖核酸(mRNA)在PCa组织中的表达及其临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月—2015年9月上海交通大学医学院附属新华医院肿瘤科和泌尿外科手术切除PCa患者120例为PCa组，年龄52～81(66.34±8.26)岁，其中<65岁53例，≥65岁67例；血清前列腺特异性抗原(PSA)≤10 ng/ml 59例，>10 ng/ml 61例；临床分期[10]：T2期51例，T3期40例，T4期29例；病灶转移36例，未转移84例；Gleason评分[10]：≤7分72例，>7分48例。选取良性前列腺增生患者50例为对照组，年龄54～79(65.92±7.39)岁。本研究经医院伦理委员会批准,患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 PCa病例选择标准 (1)纳入标准：①患者术前经造影等手段检查；②术后经病理确诊，临床资料完整；③全部患者均进行手术切除治疗，术前未进行其他辅助性治疗。(2)排除标准：①合并其他免疫系统疾病；②术前经内分泌及化疗治疗。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 前列腺组织miR-103、OLFM4 mRNA表达检测：手术中取PCa组织和良性前列腺增生组织，生理盐水清理干净后，置-80 ℃冰箱备用。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-103、OLFM4 mRNA水平。将上述样本组织匀浆化，使用RNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司生产)提取PCa组织和良性前列腺增生组织总RNA，根据反转录试剂盒(日本Takara公司生产)说明书反转录成cDNA(反转录反应体系：总RNA 2 μl、RNase Free dH2O 20 μl、PrimeScript RT Master Mix 4 μl )。以cDNA为模板，根据荧光定量PCR试剂盒说明书(北京天根生化有限公司生产)使用荧光定量PCR仪(上海罗氏诊断产品有限公司，型号 LightCycler®96)检测样本中miR-103、OLFM4 mRNA的表达水平(反应体系：cDNA模板0.5 μl、ddH2O 5 μl、正向引物0.5 μl、反向引物0.5 μl、2×Taq PCR master mix 6.5 μl)。用U6作为miR-103的内参，β-actin作为OLFM4的内参对mRNA标准化，通过2-△△Ct分析miR-103、OLFM4 mRNA的表达水平。引物由北京安必奇生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.2 随访情况：对术后出院的PCa患者进行为期5年的随访，每月随访1次，截止时间为死亡时间或至2020年9月30日，以电话或复查形式记录患者术后生存情况，未出现失访病例。

2 结 果

2.1 2组miR-103、OLFM4 mRNA表达水平比较 PCa组癌组织中miR-103和OLFM4 mRNA表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 2组前列腺癌患者miR-103、OLFM4 mRNA表达水平比较

2.2 miR-103、OLFM4 mRNA在不同PCa临床病理特征的表达比较 分别以PCa组织中miR-103、OLFM4 mRNA表达水平中位数0.31和0.43为标准分为高、低表达组，大于中位数为高表达，等于或小于中位数为低表达。PCa组织中miR-103、OLFM4 mRNA表达水平在不同年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)；在不同PSA水平、临床分期、有无病灶转移、Gleason评分比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 miR-103、OLFM4 mRNA在不同PCa临床病理特征中比较 [例(%)]

2.3 PCa组织中miR-103、OLFM4 mRNA表达水平与生存预后的关系 经过5年随访，120例PCa患者生存96例(80.00%)，死亡24例(20.00%)。miR-103 mRNA高表达组生存率为93.33%(56/60)，高于miR-103 mRNA低表达组的66.67%(40/60)(χ2=13.744，P=0.000)。OLFM4 mRNA低表达组生存率为68.33%(41/60)，低于OLFM4 mRNA高表达组的91.67%(55/60)(χ2=10.382，P=0.001)，见图1、2。

图1 miR-103 mRNA表达水平与PCa患者预后生存的关系

图2 OLFM4 mRNA表达水平与PCa患者预后生存的关系

2.4 影响PCa预后因素的Logistic回归分析 多因素Logistic分析发现，PSA高水平、临床高分期、病灶转移、Gleason高评分、miR-103 mRNA低表达和OLFM4 mRNA低表达均是影响PCa患者预后生存的独立危险因素(P<0.01)，见表4。

表4 PCa患者预后的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

PCa是影响全球男性生命健康的恶性肿瘤疾病，其患者多为中老年人[11]。随着人口老龄化速度加快，生活、饮食习惯的改变，我国PCa发病率逐年增长。PCa的治疗在过去几年内取得了很大进步，约80%的病例确诊为局部PCa，其总生存率较高，而晚期和转移病例生存率与之相比则显著降低[12-14]。目前PCa治疗的最大挑战是无法精确诊断疾病严重程度，以进行相应的治疗[15-17]。因此寻求可靠的生物标志物有助于PCa患者的诊断及治疗，还可在临床中起重要决策作用。

miRNA是一种非编码的单链小分子RNA，可在转录后水平调节基因表达，大量研究已证实癌细胞的正常调节机制可被miRNA的异常表达所干扰，并且已有多种miRNA已被作为PCa预后、诊断和治疗的生物标志物，如微小RNA-127-3p(miR-127-3p)和miR-143可作为肿瘤抑制剂靶向PCa中的多种癌基因，这些发现为PCa的治疗提供了新的方法[18-21]。miR-103可参与生物学功能的各种调控过程，并且在多种癌症发生发展中起到重要调控作用[22]。miR-103在不同类型肿瘤组织具有不同的调控作用，如miR-103在结肠癌患者血清中表达显著高于对照组，而在PCa细胞系中显著下调[7，23]。还有研究表明，miR-103a-3p可通过下调肿瘤蛋白D52(TPD52)的表达起到抗PCa作用，抑制癌细胞的生长[24]。本研究发现，miR-103在PCa组癌组织中的表达水平显著低于对照组，这表明miR-103可能与PCa的发病机制有关，其可能通过调节靶基因来参与PCa的发生。本研究还发现，PCa患者癌组织中miR-103表达水平与PSA水平、临床分期、有无病灶转移和Gleason评分明显相关，提示miR-103可能参与PCa的发展进程，并且与临床病理特征密切相关。

OLFM4为肿瘤抑制基因，可编码与嗅觉介质相关的蛋白，在细胞间黏附、细胞周期调控和肿瘤发生过程中起重要调节作用[25]。OLFM4在不同肿瘤组织中具有不同的表达模式。OLFM4在宫颈癌中上调，但在PCa中其表达受到阻碍，还可通过调控乳腺癌中基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达抑制乳腺癌肿瘤细胞的迁移和侵袭[26]。近几年有研究表明，OLFM4在PCa中具有抗肿瘤作用，其在前列腺增生组织中表达较高，但在PCa癌组织中则表达降低，其表达降低与前列腺癌中OLFM4启动子的CpG位点(-681、-446和-91)甲基化状态有关[9]。本研究中，OLFM4 mRNA在PCa癌组织中的表达水平显著低于对照组，与上述研究结果相一致。这表明OLFM4 mRNA在PCa组织中的表达受到抑制，可能与OLFM4启动子的CpG位点甲基化程度增加有关。本研究还发现，PCa患者癌组织中OLFM4 mRNA表达水平与PSA水平、临床分期、有无病灶转移和Gleason评分有关，这表明OLFM4 mRNA可能在PCa的发展进程中发挥作用。

本研究通过分析PCa患者术后5年生存率发现，miR-103和OLFM4 mRNA高表达患者5年生存率分别比对应的低表达患者高。这表明miR-103和OLFM4 mRNA低表达可能会降低PCa患者的术后生存率。除此之外，多因素Logistic分析发现，PSA高水平、临床高分期、病灶转移、Gleason高评分、miR-103 mRNA低表达和OLFM4 mRNA低表达均是影响预后生存的独立危险因素。这表明miR-103和OLFM4 mRNA可作为临床治疗和预后监测指标用以跟踪病情发展状况。

综上所述，miR-103和OLFM4 mRNA在PCa癌组织中均呈低表达，且与PCa患者临床病理特征及预后相关。miR-103和OLFM4 mRNA有作为PCa患者预后不良生物标志物的潜能，可为PCa的临床治疗提供新的方向，但两者在PCa中的详细作用机制还需进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

鲍文澜：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；朱传营：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；张林：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；刘海龙：进行统计学分析；郑磊贞：课题设计，论文撰写