上海地区黄瓜茎基腐病的病原鉴定

曾 蓉,高 萍,丁国强,宋志伟,高士刚,徐丽慧,戴富明*

(1上海市农业科学院生态环境保护研究所∕上海市设施园艺技术重点实验室,上海201403;2上海市农业技术推广服务中心,上海201103)

我国是黄瓜种植面积和产量最大的国家,据联合国粮食及农业组织(FAO)统计,2018年我国黄瓜种植面积为105万hm2,产量达5 629万t。上海市的黄瓜种植面积每年超过4 000 hm2,在上海的蔬菜供给中占有重要地位。

黄瓜上常发的细菌性病害的病原菌通常有2种:丁香假单胞流泪致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans,Psl)和胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense,Pcb)。Psl能引起黄瓜细菌性角斑病,叶片上出现枯斑、穿孔,严重时在果实、枝条上产生菌浓,有流胶症状,在我国各地均有发生;同时,Psl还是西瓜细菌性果腐病、甜瓜细菌性叶斑病等病害的病原,在甘肃、新疆、辽宁、山东等多个省有发生[1-3]。Meng等[4]报道,Pcb近年来在我国山东、陕西、河北、河南和辽宁等省都有发生,引起黄瓜细菌性茎软腐病。Pcb寄主范围广,包括黄瓜[3-4]、土豆[5]、番茄[6]、甜菜[7]、辣椒[8]、马蹄莲[9]等多种重要经济作物,主要引起根、茎腐烂,造成作物萎蔫、死亡,严重影响作物的产量和经济效益。

2020年5月,本课题组在上海市浦东新区祝桥镇和青浦区练塘镇设施栽培黄瓜上发现一种细菌性病害,黄瓜在茎秆基部上表现腐烂、开裂,并伴有流胶的症状,随着病情加重最终导致整株萎蔫、枯死。本研究根据柯赫氏法则分离、纯化病原菌,并通过形态特征、16S rRNA和RNA聚合酶β基因(rpoB)测序、特异性引物鉴定等方法进行鉴定,以期确定引起该细菌性病害的病原,为该病害的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及症状观察

2020年5月,在上海市浦东新区祝桥镇和青浦练塘镇设施栽培黄瓜上发现部分茎秆流胶、茎基部溃烂,后期整株萎蔫、死亡等症状,田间病株发生率为10%—20%。

1.2 病原物的分离、培养

采集有典型特征的病害样品,采用稀释分离法分离病菌。在病健交界部位切取大小约为3 mm×3 mm的组织,用75%(体积分数)的酒精表面消毒1 min后无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干水分;将组织放入离心管,加入无菌水后将组织捣碎,通过倍比稀释制成10-4、10-6、10-8的稀释菌液,每个稀释度各取100μL分别涂布于NA培养基表面,28℃黑暗培养,待菌落长出后挑取优势菌群的单菌落纯化,经过两代纯化,得到纯化的分离物PD05123-2-2。

1.3 烟草过敏反应及黄瓜致病性测定

将纯化的菌株在NA培养基上28℃培养24 h,用无菌水配制成浓度约1×108cfu∕mL的细菌悬浮液,采用浸润注射法接种到5—6真叶烟草叶片下表皮上,在26—28℃条件下保持24—48 h,检查过敏性反应。

根据柯赫氏法则,将分离物分别回接到黄瓜4叶期苗及成熟的黄瓜果实,参考孟祥龙[3]的方法进行接种,持续观察症状。

1.4 病菌PCR鉴定及序列分析

细菌基因组DNA提取参考Harju等方法[10]。除对16S rRNA进行鉴定外,还对rpoB基因序列进行测定,并利用Psl、Pcb、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum,Pcc)的特异性引物进行PCR鉴定确认。用于细菌鉴别的引物如表1所示,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR检测使用20μL反应体系,包括1×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)(北京全式金生物技术有限公司),上下游引物500 nmol∕L,模板DNA 1μL。PCR反应程序参考各引物出处文献。

所测得的序列与GenBank数据库进行BLASTn比对,并从数据库中挑选与试验菌株邻近属、种的16S rRNA基因序列,然后利用MEGA 7软件,采用邻近法(Neighbor-joining,NJ)进行1 000次Bootstraps检验,构建系统发育树[11]。

表1 细菌鉴别所用引物Table 1 Primers for identification of bacteria

2 结果与分析

2.1 田间发生危害症状

经调查,病害发生在设施栽培采收期的黄瓜植株上,病株发生率为10%—20%,症状主要表现为:植株茎秆中上部开裂,在早晨可见流出乳白色胶状物(图1A),后期胶状物干枯,变为黄褐色;若侵染茎基部,则引起茎基部腐烂,后期整株死亡(图1B、C)。

图1 黄瓜茎基腐田间症状与接种症状Fig.1 Symptoms of cucumber stem rot in field and inoculation symptoms

2.2 病原菌致病性

将病原菌分离物PD0513-2-2进行烟草下表皮接种,24 h后出现过敏坏死反应,说明分离物可能具有致病性。

病原菌喷雾接种的黄瓜(‘申青1号’)与田间症状相似,也会出现茎秆流胶、腐烂的症状(图1D),后期也会因腐烂加重而枯死;在果实上,接种部位也出现褐变、腐烂的症状,接种部位附近有白色菌浓出现(图1E)。

2.3 病原菌形态

病原菌分离物在NA培养基上菌落呈圆形,灰白色(图2),有很浓烈的臭味;在KB培养基上,菌落呈圆形,灰白色,半透明,边缘光滑,紫外灯照射下无荧光反应;革兰氏染色呈阴性。

图2 PD0513-2-2在NA培养基上的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of PD0513-2-2 colony on NA medium

2.4 病原菌分子生物学鉴定

对病原菌PD0513-2-2的16S rRNA序列进行PCR扩增,得到1 449 bp的目的片段。测序结果与GenBank中的序列库进行BLASTn分析表明,其与MH778 573.1(Pcb WBC12分离物)序列的相似性为99.86%,与邻近属、种的系统发育树结果显示(图3):PD0513-2-2与NCBI核酸数据库参考序列中的NR118228(Pcb 212)聚成一族,判断该菌可能为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种。

为进一步确认该病原,对PD0513-2-2分离物rpoB基因进行克隆及特异性引物PCR鉴定。BLASTn分析表明,rpoB基因序列与CP009 769.1(Pcb BC1分离物)序列相似性为97.14%。应用果胶酸盐裂解酶基因(pelY)特异性引物Y1∕Y2和Pcb 16S-23S基因间隔区(IGS)检测分离物PD0513-2-2,结果为阳性;应用Psl的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)特异性引物PslF∕PslR和Pcc特异性PCR引物ECCR1∕ECCF2检测分离物PD0513-2-2,结果为阴性,进一步确认该分离物为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense)。

图3 基于NJ法构建的16S rRNA系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA based on NJ method

3 讨论

本研究通过对引起上海黄瓜茎腐病的病原菌形态特征、致病性、生理生化特性鉴定、16S rRNA、ropB基因序列分析以及特异性PCR检测,确定该病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(P.carotovorumsubsp.brasiliense)。这是上海市首次发现胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种引起黄瓜茎基腐病。

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)最初被分在欧文氏菌属(Erwinia)中,后又将产生果胶酶特性的一类菌重新划分到新的果胶杆菌属(Pectobacterium),胡萝卜软腐果胶杆菌的种内遗传性比较多样,又被分为胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pcb)等多个亚种[17]。胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pcb)被列入分子植物病理学中排名前十位的植物致病细菌[18],果胶杆菌类细菌大都引起植物果实、茎秆、根等腐烂类似的症状,寄主范围也非常广,通过果胶酶与群体感应等作用机制致病[19-20]。Pcb与同属的其他亚种相比,有着更强的环境适应性,在巴西、美国、南非、以色列等国有发生报道,我国则以北方省市为主,上海属于首次发现该病原菌引起病害,在长江中下游地区也未见报道。据调查,胡萝卜软腐果胶杆菌田间自然侵染黄瓜主要危害黄瓜的茎秆基部(呈腐烂症状),其次为上部茎秆(呈流胶症状),未见危害瓜条的症状。李焕玲[21]、熊凯琳等[22]鉴定的黄瓜细菌性茎软腐病病原均能引起黄瓜果实的流胶症状。本研究组曾在田间黄瓜上接种Pcl,一般在叶片上引起角斑病的典型症状,果实上无症状;但通过沟灌等措施,加上大棚内湿度,黄瓜果实上便会呈现明显的流胶症状。推测黄瓜细菌性茎软腐在田间危害黄瓜部位的差异,可能与不同地区病害发生时大棚气候特别是湿度等环境因子有一定相关性,需进一步验证。

据调查,本次2个发病点的黄瓜均是嫁接黄瓜,且均来自省外同一供应商,因此不排除病原菌外来输入的可能。上海作为重要的贸易城市,种子、种苗的调运会加速病原菌的传播。这是胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种侵染危害黄瓜在上海及长江中下游地区的首次发现,鉴定和明确黄瓜茎基腐病的病原,有助于了解病害发生、流行规律,为该类病害的防治提供技术支持。