赤芝规模化液态深层发酵及其产物抗肿瘤活性研究

朱晓璐,韩 伟,冯 娜,唐庆九,袁 峰,徐国华,冯 杰*,张劲松

(1上海市农业科学院食用菌研究所,国家食用菌工程技术研究中心,农业部南方食用菌资源利用重点实验室,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海201403;2华东理工大学药学院制药工程与过程化学教育部工程研究中心,上海市新药设计重点实验室,上海200237;3江苏神华药业有限公司,江苏省药用真菌生物工程技术研究中心,淮安211600)

灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,为我国名贵的中药材,赤芝是栽培与应用最为广泛且可作药物使用的一种灵芝。多糖、三萜、甾醇及生物碱等物质均为灵芝中具有良好生物活性的有效成分,其中,三萜是灵芝最主要的活性成分之一。目前,研究发现的三萜类化合物已超过300种[1],由于其具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节、保护肝脏及神经等作用[2-10],近年来成为国内外学者研究的热点。

灵芝中三萜及甾醇的主要获得途径为人工栽培和液态发酵[11]。相较于人工栽培,液态深层发酵技术具有生产周期短、不受环境影响、产品质量稳定、产量大、过程可控等优势。获得高产三萜的灵芝发酵菌丝体主要有两种途径:一是对发酵过程中的工艺参数进行优化[12],二是添加外源物质调控三萜及甾醇的合成。目前已发现中药提取物、金属离子、茉莉酸甲酯、稀土元素、真菌激发子等皆可提高发酵体系中三萜及甾醇的含量[13-17]。油酸的添加可以刺激灵芝生物发酵过程中三萜的合成,从而得到高三萜含量、高收率的灵芝发酵菌丝体[18],且油酸价廉易得,具有食用安全的特点,因此成为一种良好的诱导灵芝三萜合成的外源物质[19]。

目前,有关灵芝中三萜液态深层发酵的研究尚停留在实验室阶段,规模化生产的报道很少。本实验室前期进行了添加油酸诱导赤芝中三萜及甾醇合成的摇瓶培养试验及6 L发酵罐培养试验[18],发现油酸的最佳添加量和时间分别为30 mL∕L和0 h,并利用Plackett-Burman设计对培养基中的葡萄糖与硫酸镁含量及发酵温度进行了优化,最终在优化条件下6 L发酵罐所得发酵产物中三萜及甾醇含量达1.076 g∕L;还探究了赤芝液态深层发酵过程中通气量[20]与温度调控[21]对三萜及甾醇含量的影响。此外,本实验室开发了一种简单可重现的两阶段搅拌速度控制策略,以实现同时满足高浓度、高产量、高生产率的赤芝三萜及甾醇液态深层发酵工艺[22];并基于Logistic和Luedeking-Piret方程构建了灵芝细胞生长、底物消耗、三萜形成的非结构动力学模型,通过Runge-Kutta遗传算法优化了模型的动力学参数,该模型可指导赤芝液态深层发酵的工业化生产[23]。基于此,本研究拟采用工业级别1 000 L发酵罐进行放大,将获得的赤芝菌丝体发酵浓缩物(包括菌丝体及胞外液)经醇提浓缩后,再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,对不同萃取物的抗肿瘤活性进行测定与评价,以期筛选出赤芝发酵产物的活性部位,进而为赤芝液态深层发酵的规模化制备及其活性成分研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株和细胞

赤芝Ganoderma lucidumG0023由上海市农业科学院食用菌研究所深加工技术与发酵工程研究室提供。

L1210:小鼠白血病细胞株;K562:人慢性髓原白血病细胞株。以上细胞株均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要试剂

5-氟尿嘧啶(5-FU,美国Sigma公司);Alamar Blue Assay Kit(美国Biosource公司);RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)(美国Gibco公司);青霉素、链霉素(美国Amresco公司);乙醇、石油醚、乙酸乙酯均为国药试剂分析纯。

1.2.2 主要仪器

1 000 L发酵罐(江苏神华药业有限公司);旋转蒸发仪(德国BüCHI公司);真空离心浓缩仪(德国Christ公司);多功能倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司);二氧化碳培养箱、超低温冰箱(美国Thermo Forma公司);细胞计数仪(美国Beckman-Coulter公司);台式高速大容量离心机(德国Eppendorf公司);电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 培养基

种子培养基:葡萄糖20 g∕L,801酵母粉3 g∕L,磷酸二氢钾2 g∕L,七水硫酸镁2 g∕L,自然pH。

发酵培养基:油酸30 mL∕L,葡萄糖30 g∕L,801酵母粉3.5 g∕L,磷酸二氢钾2 g∕L,七水硫酸镁2 g∕L,自然pH。

1.4 培养方法

1.4.1 斜面培养

挑取保藏菌株接种于PDA培养基上,并于26℃进行活化培养。

1.4.2 种子液培养

将菌块接种到种子培养基中,制备种子液。

1.4.3 发酵培养

转接种子培养液到1 000 L发酵罐中,装液量700 L,接种量10%;培养温度26℃;无搅拌,100 r∕min;通气比0.8,对应通气量560 L∕min。

1.5 测定方法

发酵过程中每隔24 h取样检测pH;将赤芝菌丝体用95%(体积分数,下同)乙醇清洗,去除表面附着的油酸,离心后收集菌丝体,取适量按料液比1∶50(g∕mL)加入95%乙醇并用细胞破碎仪破碎4 min,再于60℃、400 W条件下超声提取1 h,重复1次,离心合并上清液,定容后采用香草醛-冰醋酸法[21]测定三萜及甾醇含量。

1.6 样品的浓缩、提取与制备

发酵结束后,将700 L发酵液直接减压浓缩获得30 L待用的赤芝发酵浓缩物,然后加入70 L无水乙醇浸提48 h,再将其残渣过滤后以14 L无水乙醇浸提2次,每次24 h,得到的乙醇提取物经减压浓缩后,依次用石油醚、乙酸乙酯等体积萃取各3次,分别减压浓缩回收溶剂,得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和剩余水溶性物质,取少量各萃取物进行减压离心浓缩后备用。

1.7 抗肿瘤活性试验

精确称取3种萃取物,在无菌条件下用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成40 mg∕mL(作用终质量浓度200μg∕mL)的样品溶液,再依次将样品稀释成20 mg∕mL(作用终质量浓度100μg∕mL)、10 mg∕mL(作用终质量浓度50μg∕mL)和5 mg∕mL(作用终质量浓度25μg∕mL)备用。

将L1210、K562细胞分别接于RPMI 1640培养基中,放入5%CO2培养箱中于37℃及饱和湿度下进行传代培养。

取对数生长期的L1210、K562细胞分别以RPMI 1640培养基稀释成2×104个∕mL的细胞悬液,按每孔199μL加入96孔板,于培养箱中培养4 h后再加入1μL不同浓度待测样品,每个浓度3个平行。阴性对照为1μL的DMSO,阳性对照为1μL的5-FU和1μL的油酸(作用终质量浓度皆为50μg∕mL),置于培养箱中72 h后取出,每孔加入30μL 0.1 mg∕mL Alamar Blue试剂,继续培养4—6 h后,于570 nm和600 nm两个波长下测定吸光度值。依据Alamar Blue试剂计算公式得出各样品对肿瘤细胞的抑制率[24]。

式中:A1为样品在570 nm波长下的吸光度;A2为样品在600 nm波长下的吸光度;A3为阴性对照在570 nm波长下的吸光度;A4为阴性对照在600 nm波长下的吸光度。

1.8 统计分析

pH、三萜及甾醇含量的测定以及抗肿瘤活性试验均作3次平行重复,试验数据以平均值±标准偏差表示。采用Excel 2013软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 赤芝菌丝体发酵过程中三萜及甾醇含量测定

液态深层发酵过程中的pH变化范围为4.44—5.00,呈现出缓慢降低的趋势,这与发酵过程中酸性代谢产物的生成有关,也符合灵芝的液态深层发酵规律[25]。

如图1所示,与相同条件下未添加油酸的赤芝发酵产物中的三萜及甾醇含量变化相比,添加油酸的赤芝液态深层发酵过程中处于延滞期的时间很短,可以快速进入对数生长期,三萜及甾醇含量增长较快,并于24 h后保持稳定增长的态势,120 h时达到最大值8.91 mg∕(100 mg干菌丝)。可见,油酸的添加对促进赤芝中三萜及甾醇的合成具有重要作用。

图1 添加油酸对赤芝液态深层发酵过程中三萜及甾醇含量的影响Fig.1 Effects of oleic acid on the content of triterpenoids and sterols in submerged fermentation of G.lucidum

2.2 赤芝发酵产物不同萃取物的抗肿瘤活性

由图2可知,在高浓度条件下,石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和剩余水溶性物质对L1210细胞增殖均表现出较好的抑制作用;中等浓度时,石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物依旧有着良好的抗肿瘤活性,抑制率均高于90%,而剩余水溶性物质抑制率下降较明显;低浓度条件下,各萃取物抑制率均有一定程度下降,但乙酸乙酯萃取物的抑制率仍达到了83.65%,可见其对L1210细胞有着极强的抑制作用。油酸对L1210细胞无抑制效果,因此可以忽略各萃取物中可能残留的油酸对抑制率结果的影响。

如图3所示,石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物在200μg∕mL和100μg∕mL时对K562细胞的抑制率高达89%以上,而在50μg∕mL和25μg∕mL时下降明显,但与阳性对照5-FU相比,50μg∕mL的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物的抑制率仍略高;剩余水溶性物质在高浓度条件下抑制率仅为62.75%,其余浓度条件下均不到30%,对K562的抑制作用不佳。同样,油酸对K562细胞几乎亦无抑制效果,因此可以忽略各萃取物中可能残留的油酸对抑制率结果的影响。

图2 不同萃取物对L1210细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibition of different extracts on the proliferation of L1210 cells

图3 不同萃取物对K562细胞增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition of different extracts on the proliferation of K562 cells

3 讨论与结论

本研究采用添加油酸促进液态深层发酵过程中赤芝三萜及甾醇生成的方法,以1 000 L的工业级别发酵罐规模化制备获得30 L赤芝发酵浓缩物。对比早期200 L搅拌槽生物反应器[26],本研究在规模上取得了较大进展,此外,所得赤芝发酵产物中的三萜及甾醇含量相较于先前报道[27-28]也表现出了较大优势。研究发现:石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对L1210及K562两种肿瘤细胞都表现出良好的抑制作用,其抑制作用强度均高于剩余的水溶性物质,由此可推测弱极性的甾醇及中等极性的三萜类化合物可能是发酵产物中主要的抗肿瘤活性物质,这为赤芝液态深层发酵产物后续的分离纯化及其在医药、食品、保健品行业的研究与应用提供了依据,也为今后规模化制备赤芝发酵产物开拓了思路。