基于分子对接技术筛选抗新型冠状病毒的先导化合物

崔鹤蓉，陈可点，王 成，亓金钗，吴倩文，戴子琦，张 玫，徐 冰，王鹏龙，雷海民

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

由2019 年新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染所致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)具有传染性强、传播迅速、死亡率高等特点，严重危害人类健康[1-4]，仅在2个月已造成7.7万余人感染，2 500余人死亡[5-6]。目前临床尚无针对SARS-CoV-2的特效药物，主要采用传统临床治疗非典型肺炎(SARS)患者的干扰素、利巴韦林、洛匹那韦-利托那韦(lopinavir-ritonavir)等药物治疗COVID-19患者，该疗法具有明显的不良反应且易产生耐药性[7]。亟需开发安全有效、价格低廉、推广性强的潜在药物，使SARS-CoV-2做到可防、可控、可治。研究表明，冠状病毒主要蛋白酶(3CLpro)在病毒的复制中发挥了重要作用，能够通过抑制3CLpro功能，从而阻断SARS-CoV-2在宿主体内的复制，因此3CLpro是抗SARS-CoV-2的重要靶点[8]。课题组长期致力于基于“配伍-拼合”思路的中药先导化合物发现与开发研究，在前期国家863项目、科技重大专项等课题的支持下，建立了涵盖3 000余种化学实体的样品库，在药物合成及活性筛选方面积累了一定的研究思路和技术方法。目前，课题组已经搜集、合成并证实具有抗病毒活性的中药活性成分及系列衍生物4类120种，包括白桦脂酸等三萜类成分和海鞘醇、胆甾醇等甾体类成分等。基于此，本研究采用分子对接技术，以冠状病毒纤突蛋白(S蛋白)和血管紧张素转化酶2(ACE2)受体的结合蛋白作为目的靶点，评价“配伍-拼合”化合物库中4类120种化合物与目的靶点的结合能力，筛选潜在候选药物并对其进行分析，以期为抗SARS-CoV-2药物的研发创制提供依据。

1 材料与方法

1.1软件及数据库 目的靶点处理及分子对接主要采用AutoDock 4.2.6、MGLTools 1.5.6、PyRx、Q-Site Finder等软件及RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org)；化合物处理主要采用Chemdraw 12.0、PyMol、GuassView 5.0、Guassian 09W等软件；图像绘制采用Discovery Studio 2016 Client与PyMol等软件。

1.2目的靶点前处理 根据文献确定PDB编号为6vw1的蛋白晶体作为研究对象，晶体结构分辨率为2.68 Å，见图1。从RCSB PDB 数据库(http://www.rcsb.org)中获得SARS-CoV-2-S-ACE2结合蛋白的三维结构，删去水分子，添加极性氢并修复不完整残基得到优化受体，以Q-Site Finder预测得到作用位点(结合位点坐标X=84.540 9，Y=16.269 3，Z=139.080 3)，Q-SiteFinder是比较经典的基于能量的结合位点的预测算法，这个算法的具体内容可以分为以下几步，首先将甲基探针初始化在蛋白质的表面，然后计算蛋白质和所有甲基探针之间的相互作用能量，这里的作用力是指范德华力，作用力较强的探针会被保留下来，最后通过每个区域探针的数量进行排序来确定最终的结合位点。X、Y、Z表示所确定的结合位点的坐标。作为活性位点，生成结合口袋，exhaustiveness设定为8。将与编号为6vw1的蛋白对接结合能绝对值较高的化合物与3CLpro蛋白(PDB ID：6LU7)进行对接，验证初步预测结果。

图1 SARS-CoV-2-S-ACE2结合蛋白晶体结构

1.3化合物的前处理 基于“配伍-拼合”化合物库中搜集白桦脂酸类、薯蓣皂苷元类、甾醇类和鬼臼毒素类4类120种衍生物的三维结构，由Guassian和Sybyl X 2.0的分子能量最小化模块生成形状和静电匹配的最小能量构象，得到优化配体。

1.4分子对接 对上述优化配体分别与优化受体的结合口袋通过Grids得到小分子拮抗剂与蛋白质相互作用的可能活性构象，进行半柔性分子对接，构象为“BEST”，将对接成功的化合物按照打分值binding affinity(kcal·mol-1)绝对值大小降序排列，保留前3%的化合物作为候选SARS-CoV-2-S-ACE2结合阻断剂，将结果(结合能)与基准值(-1.435 kcal·mol-1)[8-9]以及所有化合物的平均结合能(-10.1 kcal·mol-1)分别进行比较分析。

1.5图像绘制 导出3CLpro蛋白(PDB ID：6LU7)、与编号为6vw1的蛋白对接结合能绝对值较高化合物的PDB文件，经DS软件优化后，导入Pymol进行图像绘制。

2 结果

2.1白桦脂酸类化合物的结合能力 结果显示，鬼臼毒素类、甾醇类、薯蓣皂苷元类和白桦脂酸类4类120种衍生物与SARS-CoV-2-S-ACE2的平均结合能为-10.1 kcal·mol-1，7种化合物对接失败。其中白桦脂酸类化合物(28种，见表1)与SARS-CoV-2-S-ACE2的平均结合能为-11.813 6 kcal·mol-1，低于参考文献中的基准值(-1.435 kcal·mol-1)和所有化合物的平均结合能(-10.1 kcal·mol-1)，表明白桦脂酸结构母核与SARS-CoV-2-S-ACE2具有较好的结合能力；BH-11、BH-12为打分值前3%化合物，但与其他白桦脂酸类化合物之间的结合能相差不大，表明不同氨基酸的引入几乎不会影响白桦脂酸结构母核的结合能力，BH-11、BH-12、BH-9(结合能绝对值前3)与SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro蛋白的结合位点预测结果见图2，其中BH-11、BH-12、BH-9与3CLpro蛋白的结合能分别为-8.56、-7.82、-8.42 kcal·mol-1。

图2 白桦脂酸类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro的结合位点预测

表1 白桦脂酸类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能

2.2薯蓣皂苷元类化合物的结合能力 结果显示，薯蓣皂苷元类化合物(18种，见表2)与SARS-CoV-2-S-ACE2的平均结合能为-11.261 1 kcal·mol-1，低于参考文献中的基准值(-1.435 kcal·mol-1)和所有化合物的平均结合能(-10.1 kcal·mol-1)，表明薯蓣皂苷元结构母核与SARS-CoV-2-S-ACE2具有较好的结合能力；DG-04(薯蓣皂苷元-BOC脯氨酸)和DG-13(薯蓣皂苷元-脯氨酸)的结合能绝对值相对较大，表明脯氨酸的引入能增强薯蓣皂苷元与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能力，DG-13、DG-04、DG-02(结合能绝对值前3)与SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro蛋白的结合位点预测结果见图3，其中DG-13、DG-04、DG-02与3CLpro蛋白的结合能分别为-8.49、-7.31、-7.94 kcal·mol-1。

表2 薯蓣皂苷元类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能

图3 薯蓣皂苷元类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro的结合位点预测

2.3甾醇类化合物的结合能力 结果显示，甾醇类化合物(32种，见表3)与SARS-CoV-2-S-ACE2的平均结合能为-10.15 kcal·mol-1，低于参考文献中的基准值(-1.435 kcal·mol-1)和所有化合物的平均结合能(-10.10 kcal·mol-1)，化合物1(3β-O-乙酰化胆甾醇)为打分值前3%化合物，其结合能力明显强于其他甾醇类化合物，表明乙酰基能增强胆甾醇与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能力，化合物1、18、10(结合能绝对值前3)与SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro蛋白的结合位点预测结果见图4，其中化合物1、18、10与3CLpro蛋白的结合能分别为-8.15、-8.13、-7.19 kcal·mol-1。

表3 甾醇类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能

图4 甾醇类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro的结合位点预测

2.4鬼臼毒素类化合物的结合能力 结果显示，鬼臼毒素类化合物(42种，见表4)与SARS-CoV-2-S-ACE2的平均结合能为-8.641 46 kcal·mol-1，低于参考文献中的基准值(-1.435 kcal·mol-1)，高于所有化合物的平均结合能(-10.1 kcal·mol-1)，表明鬼臼毒素结构母核与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能力较差，不适合开展相关研究。其中结合能绝对值较高的化合物P-19、P-23与3CLpro蛋白的结合能分别为-5.28、-6.08 kcal·mol-1，验证了上述推论。

表4 鬼臼毒素类化合物与SARS-CoV-2-S-ACE2的结合能

3 讨论

SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)相似，属于β冠状病毒[10]。受体结合很大程度上决定了冠状病毒的宿主范围和组织嗜性[7，11]。S蛋白对于病毒进入细胞过程中的病毒-细胞受体相互作用是必不可少的[7，11]。中国科学院上海巴斯德研究所[12]和武汉病毒研究所[10]的科学家先后分别发现：SARS-CoV-2和SARS病毒一样，均是通过利用S蛋白结合人体细胞表面的ACE2蛋白进入细胞。此外研究表明，ACE2的表达与冠状病毒的表达、复制均密切相关[13-14]。因此ACE2和S蛋白被认为是开发针对SARS-CoV-2的抗病毒药物的诱人靶标[12-15]。6vw1蛋白(DOI：10.2210/pdb6VW1/pdb)是SARS-CoV-2与人ACE2的受体结合域，是冠状病毒受体识别的结构基础，被选作本研究目的靶点以筛选设计小分子破坏ACE2和S蛋白之间的相互作用，进而展开具有针对性的研究。3CLpro的主要功能是介导靶向CoV非结构性蛋白(NSPs)成熟，参与RNA转录翻译、蛋白合成加工及修饰、蛋白复制和宿主感染等重要过程。因此，抑制3CLpro活性将阻止病毒的感染和复制，这使3CLpro成为小分子抑制剂的主要靶标之一，且尚未发现人体内具有类似裂解特异性的识别蛋白酶，所以这种小分子抑制剂具有较好的安全性[16-18]。通过计算ACE2蛋白结合能较低的化合物与3CLpro蛋白的结合能力，能进一步筛选出具有抗SARS-CoV-2潜力的优势化合物。

几千年来，中医药在疫病的防治方面形成了系统的理论并积累了丰富的临床经验，清肺排毒汤等中药复方在临床应用中被证实能较好地抗SARS-CoV-2活性[19-20]。中药在抗病毒方面具有许多化学药物所不具备的优点，中药治疗病毒感染性疾病不仅以清除体内病原体为目的，而且能通过调动机体特异性和非特异性免疫功能来增强抗病毒感染的能力。中药有数千年的临床应用历史，其安全性和有效性得到大家的广泛认可，同时中药有效成分具有结构多样、生物活性丰富等多方面的优势，是新药开发和先导化合物发现的宝贵资源。基于中药及中药复方和分子对接技术[21-22]进行抗SARS-CoV-2药物的筛选，可以减少盲目性，提高药物研发的效率。