RP-HPLC法测定当归龙荟丸中3种成分的含量

于晓光，乔 健，王 晨，王 辉

(秦皇岛市九龙山医院药剂科，秦皇岛 066000)

当归龙荟丸具有泻火通便的功效，临床主治肝胆火旺、心烦不宁、头晕目眩、耳鸣耳聋、胁肋疼痛、脘腹胀痛和大便秘结等症[1-4]，该药由酒当归、龙胆、芦荟、青黛、栀子、酒黄连、酒黄芩、盐黄柏、酒大黄、木香和人工麝香11味药材经粉碎、配研、混合和干燥等工序加工制成[5]。方中黄芩有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效[6-9]，黄柏有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮等功效[10-13]，龙胆有清热燥湿、泻肝胆火等功效[14-17]。现阶段随着生活、工作压力的不断增大，以及熬夜等不良习惯的影响，患有肝胆火旺、心烦不宁的人群较多，当归龙荟丸属中药方剂，临床使用较多。当归龙荟丸现收载于《中国药典》2015年版一部，标准中无含量测定项，不能较好地控制该品种的质量。本文针对黄芩、黄柏和龙胆3味药材[18-21]，采用RP-HPLC法检测当归龙荟丸中黄芩苷、龙胆苦苷和盐酸黄柏碱3种成分的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent HPLC 1260 infinity型高效液相色谱仪，配备G1311B型四元泵、G1229B型自动进样系统和G1314型二极管阵列检测器等(美国安捷伦仪器公司)；Waters Spherisorb ODS-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美国沃特世仪器公司；AB 135-S型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器公司)；KQ-300 VDB型双频超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct 8型纯水系统(美国密理博仪器公司)。

1.2试药 当归龙荟丸(规格：6 g·袋-1，批号分别为：20190127、20191113、20191202)，北京同仁堂制药有限公司。对照品：黄芩苷(批号110715-201821，质量分数为95.4%)，龙胆苦苷(批号110770-201918，质量分数为97.1%)，盐酸黄柏碱(批号111895-201805，质量分数为94.9%)，均购于中国食品药品检定研究院。甲醇和乙腈均为色谱纯，购自德国MERCK公司；磷酸，分析纯，购自国药集团上海化学试剂厂；实验用水为自制纯化水。

2 方法

2.1色谱条件 采用Waters Spherisorb ODS-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：276 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：32 ℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脱。洗脱程序见表1。

表1 洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取3种成分对照品，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成3种成分质量浓度分别为194.20、57.24、94.90 μg·mL-1的单一对照品储备液；精密量取3种单一对照品储备液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.2.2供试品溶液 取当归龙荟丸2袋，研细，精密称取2.0 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇35 mL，超声处理30 min(超声频率60 kHz，功率200 W)，放冷至室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液 按照当归龙荟丸药材比例和加工方法分别制备缺龙胆、黄芩和黄柏的阴性样品，分别按照2.2.2项下方法制得阴性对照溶液。

2.2.4对照药材溶液 按照当归龙荟丸药材加工方法分别制备龙胆、黄芩和黄柏的对照药材样品，分别按照2.2.2项下方法制得对照药材溶液。

2.2.5空白溶液 按照2.2.2项下方法制备不含供试品的空白溶液。

2.3方法学考察

2.3.1专属性实验 分别取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录色谱图。结果3种成分与相邻峰之间的分离度均大于1.5，混合对照品溶液与供试品溶液中3种成分色谱峰保留时间一致，阴性对照溶液无干扰，表明该方法专属性良好。见图1。

2.3.2线性关系考察 取2.2.1项下制备的单一对照品储备液，分别精密吸取适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制备系列标准曲线溶液；按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，收集色谱图。以待测物响应值为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)进行线性回归。结果见表2。

表2 回归方程和线性范围

2.3.3精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样10 μL，重复进样6次，结果3种成分精密度RSD值分别为0.92%、1.14%、0.76%，表明仪器精密度良好。

2.3.4重复性实验 取当归龙荟丸(批号20190127)，按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积。结果3种成分重复性RSD值分别为1.83%、2.04%、1.62%，表明该方法重复性良好。

2.3.5稳定性实验 取当归龙荟丸(批号20190127)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，于室温下分别放置0、3、6、9、12、24 h，按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积。结果3种成分稳定性RSD值分别为2.12%、1.25%、1.47%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6回收率实验 取当归龙荟丸(批号20190127)，倒出内容物，置于研钵中研细，精密称取1.0 g，置于25 mL量瓶中，平行称取6份，分别加入3种成分单一对照品储备液适量，后续按照2.2.2项下方法处理，制得6份加样供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，收集色谱图，根据色谱图峰面积计算待测成分的平均回收率。结果见表3。

表3 回收率实验结果 (n=6)

2.4样品含量检测 取3批当归龙荟丸，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，收集色谱图，计算3份供试品中3种成分的含量。结果见表4。

表4 含量测定结果

3 讨论

3.1检测波长的确定 取3种成分对照品，加甲醇制备成质量浓度均为10 μg·mL-1的波长测试溶液，按照2.1项下色谱条件，设置二极管阵列检测器，波长扫描范围为200～400 nm，分别进样10 μL，记录色谱图和光谱图。结果发现，3种成分的最大吸收波长分别为271、280、283 nm，波长相近，但由于龙胆苦苷的信号强度相对较低，因此选择276 nm 作为检测波长。

3.2流动相的确定 实验选择甲醇-水和乙腈-水流动相体系，检测其对3种待测成分分离的影响。结果显示，选择甲醇-水体系时，盐酸黄柏碱分析时间长，色谱峰展宽、拖尾；选择乙腈-水体系时，3种成分分离良好，且分析时间短，色谱峰峰形尖锐。因此实验对水-2 mL·L-1磷酸和水-2 mL·L-1冰醋酸进行了考察，对梯度洗脱中流动相的比例进行摸索，最终确定以乙腈-2 mL·L-1磷酸作为流动相体系，按照2.1项下色谱条件对当归龙荟丸中3种成分的含量进行测定。结果显示，色谱图基线平稳，色谱峰峰形尖锐，待测成分均能达到有效分离，定量结果准确。

3.3提取方法的优化 当归龙荟丸由11味药材组成，基质较为复杂，前处理方法的优化对于提高分析效率和结果准确性有重要影响。取当归龙荟丸，按照2.2.2项下方法制备溶液，分别选择甲醇、体积分数分别为95%、85%、75%的甲醇作为提取溶剂时，考察对3种成分提取情况的影响，结果选择甲醇作为提取溶剂时，提取效果最佳；再分别考察提取时间和超声功率的影响，最终确定以甲醇作为提取溶剂，超声频率为60 kHz、功率为200 W，超声处理30 min为最佳提取条件。

综上所述，本研究建立了能同时测定当归龙荟丸中的黄芩苷、龙胆苦苷和盐酸黄柏碱含量的RP-HPLC法，结果表明，该方法适用于当归龙荟丸的质量控制，可为国家标准的完善提供参考。