复方石杉碱甲-虾青素脂质体的制备及评价*

魏寒梅，刘 洁

(1 广州华夏职业学院卫生健康学院，广东 广州 510935；2 中南大学湘雅二医院，湖南 长沙 510007)

阿尔兹海默症(AD)是一种常见的神经退行性疾病，是仅次于心血管疾病、癌症和脑卒中的第四大致死疾病。石杉碱甲(Huperzine A，HupA)，是从中国民间草药千层塔中分离得到的新型石松类生物碱单体，作为胆碱酯酶抑制剂常被用于临床治疗AD[1]。虾青素(Astaxantin，AXT)，一种极具潜力的类胡萝卜素，具有清除自由基、延缓衰老、降低脂质过氧化等多种生物活性，近年来在医药领域被广泛应用[2]。我们前期工作发现，与单独给药相比，联合应用能显著提高对AD模型的保护作用[3]。然而由于血脑屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)能阻碍肽类、多数极性小分子、大分子药物入脑，成为了AD等神经退行性疾病和其他脑部疾病治疗中的一大障碍[4]。脂质体(Lipsomes)作为一种新兴的制剂类型，一直是纳米制剂领域的重点研究方向之一，具有可修饰靶向性、生物利用度高、刺激性小、不良反应少等优点[5-7]。本实验拟通过脂质体同时包封石杉碱甲和虾青素，以包封率为指标，对复方脂质体制备的处方工艺影响因素进行考察与优化，为后期的研发工作奠定实验基础。

1 仪器与材料

AUW120D型电子天平，日本岛津公司；KQ5200DE型数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；JY92型细胞超声破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司；RE311型旋转蒸发仪，日本雅马拓公司；ZS90型激光纳米粒度仪，英国马尔文公司；FEI Tecnai G2 Spirit型透射电子显微镜，美国FEI公司。

大豆卵磷脂(纯度>98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆固醇(纯度>95%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖凝胶-G50，北京化学试剂公司；石杉碱甲原料药(含量>98%)，浙江万邦药业有限公司；虾青素原料药(含量>98%)，四川省维克奇生物科技有限公司；虾青素对照品(HPLC≥98%)，四川省维克奇生物科技有限公司；石杉碱甲对照品(HPLC≥98%)，四川省维克奇生物科技有限公司；其他试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 薄膜—超声法制备复方石杉碱甲-虾青素脂质体[8-9]

分别称取大豆磷脂、胆固醇、石杉碱甲和虾青素适量，加氯仿20 mL 溶解，在40 ℃恒温水浴锅中进行旋蒸，出现均匀薄膜后，加入适量pH 6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，旋转蒸发，至形成均匀乳液，冰水浴探头超声后过0.45 μm微孔滤膜，既得。

2.2 包封率的测定

2.2.1 色谱条件

石杉碱甲色谱条件：Agilent C8色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾(pH值为3.90)-乙腈 (86:14)； 检测波长：313 nm； 流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

虾青素色谱条件： Symmetry C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm, Waters, USA)；流动相：甲醇-水(89:11)；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃ 检测波长：476 nm；进样量：20 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

石杉碱甲对照品溶液：精密称定10.12 mg，置于20 mL量瓶内，用80%(v/v)甲醇溶液溶解后并稀释至刻度，配制成浓度为506 μg/mL的储备液。

虾青素对照品溶液：精密称取5 mg虾青素于100 mL容量瓶中，加6 mL二氯甲烷超声辅助溶解，色谱甲醇定容至100 mL，得到浓度为50 μg/mL 的虾青素储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密量取石杉碱甲-虾青素复方脂质体 1 mL置于50 mL量瓶中，加适量 80%(v/v)甲醇溶液，45 kHz 超声20 min使其破乳完全，取出放至室温后，用80%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，离心取上清液过滤，备用。

2.2.4 标准曲线绘制

石杉碱甲：分别精密移取储备液适量，用80%(v/v)甲醇稀释成浓度为5.06、10.12、25.30、40.48、50.60 μg/mL的系列质量浓度的溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL。以峰面积(A)对样品质量浓度(C,μg/mL)作线性回归，得回归方程 A=28.379 C-4.9862(r=0.9999，n=5)。表明石杉碱甲在5.06～50.60 μg/mL内线性关系良好。

虾青素：精密吸取 0.2、1、2、3、4、5 mL上述储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，得到浓度为1、5、10、15、20、25 μg/mL 的虾青素待测液，按“色谱条件”项下进样，记录虾青素的峰面积。以虾青素的浓度为横坐标(C)，以样品峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归分析，得到虾青素在浓度为1～25 μg/mL的标准曲线方程：Y=203912X-49894(n=3，r=0.9998)，结果表明，虾青素在1～25 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

石杉碱甲：取上述石杉碱甲系列溶液中5.06 μg/m L、25.30 μg/m L、40.48 μg/m L的溶液各五份，通过高效液相色谱仪进样分析测定记录其峰面积，分别在日内和日间重复测定，准确考察日内和日间精密度。结果日内、间变异系数在2.0%以内，精密度符合实验要求。

虾青素：取上述虾青素系列溶液中0.05、0.2、1、5、25 μg/mL 五种浓度的标准溶液，经0.45 μm有机微孔滤膜过滤后，按“色谱条件”项下进样测定，于一日内连续测五次，以计算日内精密度，同样按“色谱条件”项下进样测定，连续测定三日，以计算日间精密度。结果日内、间变异系数在2.0%以内，精密度符合实验要求。

2.2.6 重复性试验

分别取六份脂质体样品溶液，按照2.2.3项下进行供试品制备，结果石杉碱甲、虾青素的含量RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 回收率试验

石杉碱甲：配制低，中，高3个浓度的石杉碱甲80%甲醇溶液，精密移取上述溶液各1 mL，置于20 mL量瓶中，使得石杉碱甲浓度为20.05，25.30，30.00 μg/mL。然后向其各加入处方量的空白脂质体，按供试品制备项下方法制备溶液。结果回收率分别为98.59%±1.35%、98.21%±1.29%、99.94%±1.35%。

虾青素：分别精密量取份空白脂质体混悬液至量瓶中,分别加入三个浓度的虾青素对照品溶液,加甲醇定容至刻度,分别进样,测定峰面积,换算成实际测定浓度,计算方法回收率。结果回收率分别为97.70%±1.07%、100.42%±1.28%、99.38%±1.07%。

2.2.8 复方石杉碱甲-虾青素脂质体包封率的测定[10]

精密移取石杉碱甲-虾青素脂质体混悬液0.2 mL, 上样于SepHadex-G50柱,PBS洗脱,流速1 mL/min,室温下层析。用25 mL量瓶收集5-15管的洗脱液，加甲醇定容至刻度破乳，HPLC法分别测定石杉碱甲、虾青素的峰面积,代入相应标准曲线方程计算药物浓度并计算包裹在脂质体中的石杉碱甲、虾青素含量。

精密量取复方脂质体混悬液0.2 mL于10 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,超声5 min破乳。即包封率=W包/W总* 100%。

2.3 单因素优化制备工艺

2.3.1 水相介质pH 值对包封率的影响

暂定其余四项条件为：大豆磷脂浓度为 8 mg/mL；磷脂与胆固醇质量比为3:1；药脂比为1:15；石杉碱甲与虾青素的质量比为5:1；考察PBS的pH值为3.0，4.0，5.0和6.0时对复方脂质体包封率的影响。石杉碱甲包封率分别为50.50%±1.67%、53.22%±2.35%、55.97%±0.73%、57.16%±1.28%，虾青素包封率分别为39.24%±1.21%、40.76%±1.68%、43.68%±1.55%、48.69%±1.16%。结果表明：pH在6.0时两个药物的包封率均为最高，但pH的改变对包封率的改变影响不大。

2.3.2 大豆磷脂浓度对包封率的影响

固定PBS缓冲液pH值为6.0，磷脂与胆固醇质量比为3:1；药脂比为1:15；石杉碱甲与虾青素的质量比为5:1，考察大豆磷脂浓度分别为 4，8，10，12 mg/mL对复方脂质体包封率的影响。石杉碱甲包封率分别为51.63%±0.54%、54.66%±2.02%、49.84%±1.09%、49.21%±0.62%，虾青素包封率分别为37.31%±1.13%、47.22%±1.79%、49.17%±1.66%、40.89%±1.37%。结果表明：石杉碱甲在大豆磷脂浓度为8 mg/mL时，包封率较高；虾青素在大豆磷脂浓度为10 mg/mL时，包封率较高。考虑到磷脂浓度对石杉碱甲的影响较大，因此选择8 mg/mL进行下一步试验。

2.3.3 磷脂与胆固醇的质量比对包封率的影响

固定PBS缓冲液pH值为6.0，药脂比为1:15；石杉碱甲与虾青素的质量比为5:1，大豆磷脂浓度分别为8 mg/mL，考察磷脂与胆固醇投料量质量比分别为 2:1，3:1，4:1，5:1，6:1时对复方脂质体包封率的影响。石杉碱甲包封率分别为52.02%±1.49%、58.83%±0.98%、55.75%±1.73%、54.64%±0.79%，虾青素包封率分别为47.37%±2.33%、53.65%±1.46%、51.18%±1.17%、48.91%±1.58%。结果表明：磷脂与胆固醇的质量比在3:1时，两药的包封率较高。

2.3.4 药脂比对包封率的影响

固定PBS缓冲液pH值为6.0，磷脂与胆固醇质量比为3:1；石杉碱甲与虾青素的质量比为5:1，大豆磷脂浓度分别为8 mg/mL，考察石杉碱甲-磷脂药脂比分别为1:10，1:15，1:20，1:25时对复方脂质体包封率的影响。石杉碱甲包封率分别为56.92%±1.65%、65.67%±2.33%、54.86%±0.69%、50.98%±1.43%，虾青素包封率分别为41.71%±1.04%、55.85%±2.15%、44.67%±0.92%、42.39%±1.78%。结果表明：药脂比为1:15时，包封率较高。当投药量较低时，由于投入的少量药物大多在脂质体的间隙游离，故包封率不高；当投药量较高时，由于超过了脂质体的承载范围，所以包封率不高。

2.3.5 石杉碱甲与虾青素的质量比对包封率的影响

固定 PBS 缓冲液pH值为6.0，磷脂与胆固醇质量比为3:1；药脂比为1:15，大豆磷脂浓度分别为8 mg/mL，考察石杉碱甲与虾青素的质量比1:1，3:1，5:1，7:1时对复方脂质体包封率的影响。石杉碱甲包封率分别为56.52%±1.03%、65.11%±1.06%、63.44%±1.82%、57.36%±0.93%，虾青素包封率分别为41.54%±0.46%、48.48%±1.15%、45.92%±1.67%、43.27%±0.85%。结果表明：石虾比在3:1时包封率最高。

2.4 正交试验优化脂质体处方

2.4.1 因素与水平的选择

在单因素试验的基础上，以包封率为指标，排除影响不大的pH值因素，对处方工艺中的脂固比、药脂比、磷脂浓度(mg/mL)、石-虾比4个因素进行筛选，以期得到包封率高、稳定性好的复方脂质体。

2.4.2 正交试验设计与结果

根据单因素结果选择恰当的水平，用L9(34)正交试验法优化工艺处方，试验设计和试验结果分别见表1，表2。

表1 正交试验因素及水平

表2 正交试验结果

续表2

以石杉碱甲包封率为参考指标：各因素重要性的程度为A>B>C>D，最优组合为A2B2C2D2;以虾青素包封率为参考指标：各因素重要性程度为A>C>B>D，最优组合为A2B3C2D1。因为石杉碱甲的药物含量占主要地位，所以选择A2B2C2D2作为最优方案。

2.5 验证性试验

按照正交试验给出的方案制备3批复方脂质体样品，测定包封率。测得石杉碱甲包封率为65.35%±1.30%(n=3)、虾青素包封率为50.42%±2.77%(n=3)。

2.6 脂质体的形态学考察及粒径电位测定

2.6.1 形态学考察

将滴有脂质体稀释液的铜网放在染液滴里(4%硅钨酸溶液)约30 s，用滤纸吸干多余染液，自然挥干，用透射电子显微镜观察并拍摄照片。

图1 脂质体透射电镜照片(标尺=100 nm)

2.6.2 粒径电位的测定

脂质体粒径分布及大小通过动态光散射法进行测定。测定前将样品经过葡聚糖G-50凝胶柱去除游离药，将样品溶液进行适当稀释后放入相应的样品管后，置于马尔文激光粒度仪中，分别测定脂质体的粒径大小。测得粒径156.22 nm±3.71 nm (n=3)，多分散系数(PDI)为0.24±0.02 (n=3)。15日内复方脂质体的粒径、PDI稳定性见图2、图3。

图2 石杉碱甲-虾青素脂质体的粒径稳定性

图3 石杉碱甲-虾青素脂质体的多分散系数稳定性

3 结 论

石杉碱甲、虾青素均是脂溶性药物，根据脂质体的制备方法和特点，选择了简便易行，有成熟工艺的薄膜分散-探头超声法进行制备，能够得到较高的包封率。在单因素试验的基础上运用正交试验设计优化制备工艺，结果表明磷脂浓度是影响包封率较大的因素，可能是与脂质体的稳定性有关。磷脂浓度过高，形成的脂质体容易聚集，使药物泄漏。此外，药脂比是影响脂质体包封率的主要因素。药脂比越小(当药物含量一定时，脂质含量越高时)，药物的包封率越高。可见，脂质膜材的比例会影响到药物的包封率。但是减小药脂比，脂质体载药量也将减小，并且药脂比对于脂质体在体内外的释药特性也有影响。因此，选择合适的药脂比需要综合考虑各种因素。此外，胆固醇起到调节磷脂流动性的作用，磷脂与胆固醇的比例控制在2～7比较好[11]。