精喹禾灵对水稻的生长、CPR酶活性及抗氧化系统的影响研究*

2021-07-04张杰皓孙术鑫冯立志刘媛媛

广州化工 2021年12期

张杰皓，孙术鑫，张艳，冯立志，刘媛媛，张琼

(滨州学院生物与环境工程学院，山东滨州 256603)

农药是农业生产中必不可少的生产资料，但是在农业生产转向集约化生产发展的过程中，长期过量及不科学地使用农药会导致环境中农药产品(例如除草剂)残留并沿着生物链进行富集[1]。精喹禾灵，化学名称2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯，是一种有较好选择性的除草剂[2]。它被杂草叶片吸收后，可以扩散到整个杂草植株体内并在分生组织内累积，抑制杂草植株对脂肪酸等物质的合成，还抑制乙酰C0A羧化酶的生成，破坏了分生组织的生长进而使得杂草死亡[3]。然而，精喹禾灵也是一种有毒化学物质，随着它的广泛使用，它对环境和生物的危害也逐渐显露出来，已证实精喹禾灵和它的代谢物精喹禾灵酸均具有生殖毒性和肝毒性[4]。为防止精喹禾灵对生态和健康造成威胁，欧盟已禁止使用该农药，大多数的发达国家设定了相应的残留限量，但在我国它仍广泛应用于豆类等作物的杂草防除[5]。当前，国内常用HPLC法检测精喹禾灵在土壤和作物体内的残留[3,6]。

本研究以精喹禾灵为主要的研究对象，选用水稻作为受试生物，通过观察分析不同浓度下的精喹禾灵对水稻的生长、代谢酶活性及抗氧化系统的影响，深入探讨这种除草剂对非靶标植物水稻的毒性和机理，为它的安全施用提供科学依据。

1 实验

1.1 实验材料

水稻种子(秀水63号)取自中国水稻研究所(中国杭州)，除草剂精喹禾灵购自百灵威公司(中国北京)，各种抗氧化酶的测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(中国南京)，其他各种生化试剂都是分析纯度，此外还有营养土，培养皿，泡沫箱等实验材料。

1.2 水稻幼苗培育和外观生长特征观察

选取圆润饱满的水稻种子，用3%的双氧水浸泡消毒25 min后用清水冲洗数遍。消毒后的种子平铺于培养皿中，加入20 mL蒸馏水覆盖种子，室温下在黑暗环境中培养5 d。5 d后选取已发芽的种子均匀撒入营养土中，喷水浇湿，在日夜温度25 ℃/20 ℃，光暗比为12 h/12 h的环境中培养10 d，每天浇水一次。待水稻幼苗长到二叶期，选取叶长为1.5～2.0 cm的秧苗进行后续实验。

精喹禾灵原药溶于丙酮中，经稀释后按照不同浓度，一次性喷洒加药(助溶剂丙酮的浓度<0.5%)。所设的精喹禾灵的浓度梯度如下：10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，同时设置空白对照组，每个处理组三个平行，连续培养3周。水稻幼苗经过转接后，每周采样一次，记录各处理组的根长、茎长、鲜重等形态外观指标。

1.3 精喹禾灵对水稻代谢酶CPR活性的影响

为了有足够的生物量，采集生长了3周的水稻秧苗，对代谢酶活性，抗氧化酶活性等进行检测。测定CPR活性时，首先需要提取微粒体，本实验采用差速离心方法制备水稻细胞色素P450微粒体。接着利用酶标仪测定NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)的活力，具体做法可参照相关文献[7]。蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)活力的计算公式如下：

CPR活力(nmol·min-1·mg-1protein)=ΔOD550×1000/(21.1×蛋白浓度)

1.4 精喹禾灵胁迫下的水稻体内抗氧化酶活性测定

在不同采样时间采集各处理组水稻幼苗茎叶组织5 g，放入已预冷的研钵中加液氮快速研磨成粉。加入100 mM磷酸缓冲液(pH 7.5)后将样品移至离心管内，8000 r/min，4 ℃下离心15 min，去上清，将沉淀放入液氮中5 s后，立即取出置于冰箱存放30 s，取出后自然解冻。反复冻融3次后，用高速冷冻离心机在3500 r/min离心15 min，取上清液进行抗氧化酶活性测定。酶的测定严格按照试剂盒说明书要求进行，过氧化物酶(POD)测定使用紫外比色法；过氧化氢酶(CAT)使用可见光法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法。各抗氧化酶的活性最后均按样本蛋白浓度进行均一化处理。

2 结果与讨论

2.1 水稻幼苗在不同精喹禾灵浓度下的生长情况

本实验共设六组不同的处理组，各处理组精喹禾灵的浓度分别为0 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，分别编号为①、②、③、④、⑤、⑥。表1是对各处理组不同暴露时间(4 d，8 d，12 d)下外观形态(幼苗的根长、茎长及鲜重)的实验数据的整理。

表1 不同浓度精喹禾灵处理下水稻幼苗根长、茎长及鲜重

由表1可以得知，当除草剂精喹禾灵的加药浓度低于100 μg/L时，水稻幼苗的根长、茎长及鲜重都较空白组的水稻幼苗更长、更重；当精喹禾灵的浓度超过200 μg/L时，与空白相比，水稻幼苗的根长、茎长及鲜重都明显受到抑制。从上表数据可得到如下结果：低浓度的精喹禾灵是可以促进水稻幼苗的生长发育的，但是随着除草剂精喹禾灵浓度的增高，这种促进现象则会转为抑制效应，阻碍水稻幼苗的正常生长。可能的原因之一就是精喹禾灵影响了水稻的抗氧化防御系统，打破了细胞内活性氧(ROS)的产生与消失的动态平衡状态。

图1 不同浓度精喹禾灵处理组水稻幼苗的蛋白含量

与生长情况类似，随着精喹禾灵浓度的变化，植株总蛋白含量的变化也呈现出先升高后降低的趋势，如图1所示。在精喹禾灵浓度较低时，与空白对照组相比，精喹禾灵刺激水稻的蛋白合成。但当精喹禾灵浓度较高时，对水稻的蛋白合成抑制效应显著。这就表明由于低浓度农药的刺激作用，水稻蛋白质的合成量有升高趋势，且随着浓度增加，增加的值越大；而高浓度农药对水稻的毒害效果明显，首先是蛋白含量明显下降，这将对水稻幼苗的一系列生理生化反应造成影响。

2.2 水稻在精喹禾灵胁迫下的代谢酶活力变化

NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)被认为是细胞色素P450酶系的核心成分之一。细胞色素P450酶系是一种血红素氧化酶系，普遍存在于动物、植物和微生物中，重要特征之一是具有生物合成功能[8]。大量证据表明，细胞色素P450酶系参与许多除草剂的代谢。细胞色素P450酶系不仅可以催化植物体内某些重要的内源性物质的生物合成，而且还可以参与许多有毒物质和外源性物质，包含杀虫剂，除草剂，药物，环境污染物的解毒和代谢[9]。此前对不同农药的植物代谢的研究发现：PBO与阿特拉津共同处理下，离体抑制试验表明CPR酶活力几乎被抑制一半。这项结果间接表明了水稻细胞色素P450酶系对阿特拉津的代谢具有重要作用[7]。因此，测定不同精喹禾灵浓度处理的水稻细胞中NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)活力具有重要意义，可在一定程度上反映水稻幼苗对精喹禾灵的胁迫响应。

该实验的测定结果如图2所示。精喹禾灵处理后，水稻细胞的CPR活力相比不加药的空白对照组显著增强，精喹禾灵浓度在100 μg/L以下时，水稻CPR活力为1.32 nmol·min-1mg-1蛋白，是不加药对照组CPR活力的2.78倍。并且随着精喹禾灵浓度的增高，水稻CPR活力也有明显的提高，这就表明细胞色素P450酶系作为代谢酶参与了水稻对除草剂精喹禾灵的代谢。

图2 精喹禾灵对水稻NADPH-细胞色素P450还原酶活力的影响

2.3 水稻在精喹禾灵胁迫下的抗氧化酶活性变化

过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是生物体抵御氧化损伤的两种重要酶。其中，过氧化氢酶(CAT)是一种血红素蛋白，能与过氧化物酶(POD)协同催化过氧化氢生成H2O和O2，从而降低过氧化氢对细胞的氧化损伤。本实验对水稻幼苗丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力进行了分析。由图3可以看出，在本试验中，水稻细胞内POD活性随着除草剂精喹禾灵加药浓度的增加而显著增高，在100 μg/L精喹禾灵胁迫下，水稻POD活性是不加药的对照组的2.05倍。由图4可以看出，水稻细胞内的CAT活性在低浓度精喹禾灵影响下显著提高，在精喹禾灵浓度为100 μg/L胁迫下，水稻CAT活性是不加药的对照组的1.90倍，但在高浓度精喹禾灵胁迫下，水稻细胞内的CAT活性出现了降低趋势，可能原因是高浓度的精喹禾灵胁迫使得水稻细胞CAT活性不能被成功激活。这也可能是水稻暴露于高浓度精喹禾灵处理组时生长出现明显抑制的原因(表1)。

图3 不同浓度精喹禾灵处理组水稻幼苗的POD活力

图4 不同浓度精喹禾灵处理组水稻幼苗的CAT活力

MDA是生物体内脂质过氧化的重要产物，其含量的升高表明机体受到了氧化胁迫，因此通常用于反映生物体在受到各种外界影响后细胞的氧化损伤程度。由图5可以看出，精喹禾灵处理组的MDA含量与不加药的对照组相比均显著升高，在精喹禾灵浓度为100 μg/L时，水稻MDA含量是不加药的对照组的4.18倍。

图5 不同浓度精喹禾灵处理组水稻幼苗的丙二醛(MDA)含量

综合上述抗氧化酶活性和MDA含量的结果，我们认为精喹禾灵的胁迫给水稻造成了严重的氧化损伤(图5)，但农药诱导的水稻体内抗氧化酶活性的增加(图3，图4)，却在一定程度上缓解了活性氧自由基(ROS)对水稻细胞的氧化损伤，在外观上还表现为低浓度的生长刺激效应(表1)。最新的研究表明，除了农药外，重金属的添加也有类似的效应。如张盛楠等研究发现：在Cd胁迫下，添加三种外源物质均导致水稻根系中MDA含量增加，外源添加物可显著增加水稻幼苗POD、CAT的活性[10]。