UPLC-MS/MS同时检测婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐残留

张立佳，胡 雪，文 静，谢瑞龙，莫 楠，刘丽君，李翠枝

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

高氯酸盐（ClO4-）是一种公认的、有毒的、无机阴离子的持久性环境污染物，广泛用于炸药、烟花、火箭燃料的制造，从而使高氯酸盐很容易释放到环境中，导致水源、土壤、空气全部被污染[1]。高氯酸可以竞争性结合利用钠/碘转运体（sodium iodide symporter，NIS），从而干扰人体正常新陈代谢，对人体健康有害，尤其是影响胎儿和婴儿神经中枢的正常生长和发育[2]。美国环境保护署（environmental protection agency，EPA）将高氯酸盐列入污染物候选名单（contaminant candidate list，CCL）[3]。2020年欧盟发布草案，关于婴幼儿配方食品即食状态下高氯酸盐最大残留限量为0.01 mg/kg[4]。随着二氧化氯作为新一代高效消毒剂、水处理剂、漂白剂的广泛使用[5]，氯酸盐（ClO3-）作为主要副产物，能影响人体的甲状腺系统和血液系统，并降低精子的数量和活力[6-7]。婴幼儿配方奶粉中测出高氯酸盐、氯酸盐时有发生。有研究表明，对于婴幼儿配方奶粉中的高氯酸盐主要污染源来自牧场的饲料[8]，而氯酸盐的污染主要来自工厂生产线的清洁消毒和奶牛饮用过度消毒的水源[9]。由于国家目前还未制定相关限量标准，但是对婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐残留进行监控有着重要的意义。

目前国内外测定高氯酸盐和氯酸盐常用的检测方法有：离子色谱法[10-11]、离子色谱-质谱法[12-14]、液相色谱-高分辨质谱法[15]和液相色谱-三重四极杆串联质谱法[16-25]。其中离子色谱法灵敏度较低，受其他阴离子干扰较大，尤其是婴幼儿配方奶粉基质较复杂，进样溶液中存在高浓度的氯离子、硫酸根离子、硝酸根离子等干扰离子，在分析柱上易过饱和而产生拖尾现象，影响高氯酸盐的分析；离子色谱-质谱法对仪器稳定性要求极高，如离子色谱部分抑制器出现问题，存在高浓度的碱液进入质谱仪器，导致质谱仪器瘫痪的风险。液相色谱-高分辨质谱法成本较高，不适用于常规定量分析，主要应用于筛查和定性分析；液相色谱-串联质谱法具有较强的抗基质干扰能力，灵敏度较高，主要应用于测定有机化合物和蛋白多肽，很少应用到无机离子的测定，随着近几年色谱技术的突出猛进，研发出一大批新型的色谱柱，让过去的不能变为可能。

本研究采用一款新型的色谱柱，将其首次应用到高氯酸盐和氯酸盐分离，以期建立液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中高氯酸盐和氯酸盐的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Waters Anionic Polar Pesticide（2.1 mm×150 mm，5 μm）色谱柱、Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱、GHP滤膜（0.2 μm）：美国Waters公司；Thermo Acclaim TRINITY P1（50 mm×2.1 mm，3 μm）离子交换色谱柱：美国赛默飞公司。

氯酸根离子标液和高氯酸根离子标液（纯度≥99.0%）：上海安谱实验科技股份有限公司；氯酸根离子同位素内标（纯度≥99.0%）：Cambridge Isotope Laboratories公司；氯酸根离子同位素内标（纯度≥99.0%）：SOREAG公司；实验室用水为Milli-Q超纯水；乙腈（色谱纯）：德国Meker公司；甲酸（质谱纯）：天津市沃尔孚科技发展有限公司；甲酸铵（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC TQ-S 超高效液相色谱-串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）（配有电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI））：美国Waters公司；3K 30高速离心机：德国Sigma公司；KS 501涡旋混合振荡器：德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准中间溶液（10 μg/mL）的配制：分别准确吸取氯酸盐和高氯酸盐（1 mg/mL）标准储备液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，混匀，0～4 ℃避光保存。

混合标准中间溶液（100 ng/mL）的配制：分别准确吸取氯酸盐和高氯酸盐混标中间液1 mL至100 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，混匀，0～4 ℃避光保存。

混合高氯酸盐和氯酸盐同位素内标液（100 ng/mL和300 ng/mL）的配制：分别准确移取0.15 mL、0.1 mL同位素内标储备液置于100.0 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制成氯酸根-18O3离子、高氯酸根-18O4离子浓度分别为300ng/mL和100ng/mL的混合内标中间液，0～4℃避光保存。

准确吸取高氯酸盐和氯酸盐的混标中间液（100 ng/mL）和高氯酸盐和氯酸盐混合的内标中间液（100 ng/mL和300 ng/mL），用超纯水稀释，配制成质量浓度依次为0、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL的系列标准溶液，且系列标准溶液各浓度点中同位素内标氯酸根（ClO3-）18O3离子和高氯酸根（ClO4-）18O4离子质量浓度分别为15.0 ng/mL和5.0 ng/mL。以定量离子响应值为纵坐标，氯酸盐、高氯酸盐质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

1.3.2 样品前处理

称取试样1 g（精确到0.000 1 g），置于50 mL具塞离心管中，加入750 μL高氯酸盐和氯酸盐的混合内标中间液（100 ng/mL），准确加入4.25 mL0.2%甲酸水溶液，涡旋混匀2 min，再准确加入10 mL乙腈，置于水平摇床振荡提取10 min，10 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液，经乙腈饱和正己烷液液分配，除去脂肪，过0.22 μm的有机滤膜，备用，供液相色谱串联质谱联用仪测定。

1.3.3 液相色谱-串联质谱条件

（1）液相色谱条件

Waters Anionic Polar Pesticide色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm），流动相A为体积分数0.9%甲酸+50 mmoL甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈；流速0.45 mL/min；柱温50 ℃；进样体积1 μL；线性梯度洗脱：0～4.0 min，90%B；4.0～4.5 min，90%～40%B；4.5～6.0 min，40%B；6.0～8.0 min，40%～90%B；8.0～12.0 min，90%B。

（2）质谱条件

电离模式：电喷雾离子源负离子（ESI-）模式；毛细管电压3.5 kV；源温150 ℃；脱溶剂温度500 ℃；脱溶剂气流量650 L/h；碰撞室气流量0.18 mL/min；多反应监测模式检测；其他质谱条件如表1所示。

表1 高氯酸盐和氯酸盐质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of perchlorate and chlorate

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

2.1.1 提取试剂的选择

由于高氯酸盐和氯酸盐作为阴离子化合物在水中具有较好的溶解性，并且水可以充分溶解奶粉样品，有利于试样中高氯酸盐和氯酸盐提取，同时阴离子化合物在水中加入一定量的甲酸，可以提高提取效率。因此本实验选择加入适量甲酸水溶液作为提取液。由于婴幼儿配方奶粉中基质较复杂，如蛋白质、脂肪、碳水化合物和矿物质等均需要去除，研究了甲醇和乙腈体系对高氯酸盐和氯酸盐提取和净化效果的差异，结果见图1。由图1可知，当加入同等体积的甲醇和乙腈，均可以有效的去除蛋白质等基体干扰，检测结果并无显著差异，但是连续数日后进样发现，样品过夜后会有大量白色固体析出，甲醇体系对仪器和色谱柱的污染较严重，乙腈体系对仪器的污染相对较小并且静置数量日后无沉淀析出，因此选择乙腈作为提取试剂。

图1 不同溶剂净化后溶液静置析出情况（A：甲醇体系；B：乙腈体系）Fig.1 Static precipitation of the solution after purification with different solvents (A:methanol system;B:acetonitrile system)

2.2 质谱条件优化

根据氯酸盐和高氯酸盐化合物的性质，需要采用负离子模式。首先，对母离子进行全扫描，待测物响应准分子离子峰在负离子模式下获得，母离子为[M-H]-，以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描，得到各个化合物响应最佳的碎片离子。选择母离子及对应产生的2个响应较强的子离子作为定性定量依据，完全满足欧盟2002/657/EC指令[26]。

2.3 色谱条件优化

2.3.1 色谱柱的选择

氯酸盐和高氯酸盐均为极性的离子型化合物，在反相色谱柱C18柱上无法保留。本研究主要考察了两款色谱柱：Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱（3 μm，50 mm×2.1 mm）和Waters Anionic Polar Pesticide 色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）。Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱是一款离子交换型色谱柱，其填料的键合相可提供阴阳离子交换和反相的功能；Waters Anionic Polar Pesticide 色谱柱主要用于分析阴离子农药，通过两步式键合工艺，以亚乙基桥杂化颗粒为基础，键合二乙基胺，结合了Hilic和WAX双重原理，使得该色谱柱具有更好的保留特性和选择性。研究表明，通过对ThermoAcclaim TRINITY P1色谱柱条件的优化，可实现对高氯酸盐和氯酸盐的分离，但是存在着保留时间漂移，氯酸盐受基质干扰较严重，灵敏度低，色谱柱寿命短等缺点；通过对Waters Anionic Polar Pesticide 色谱柱条件的优化，可实现对高氯酸盐和氯酸盐的分离，经过连续数日大量样品的检测，高氯酸盐和氯酸盐出峰时间较稳定，不受基质的干扰，尤其是氯酸盐出峰时间后移，保证了氯酸盐不受基质的干扰。在同等条件下，其灵敏度比Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱的灵敏度至少高10倍。因此，选择Waters Anionic Polar Pesticide（2.1 mm×150 mm，5 μm）作为色谱柱。最后，研究了缓冲盐体系色谱柱进样前的平衡时间，当平衡时间低于120 min时，高氯酸盐色谱峰会有分岔现象，甚至出现双峰，氯酸盐色谱变宽，灵敏度下降。因此，最终色谱柱进样前平衡时间至少为120 min，否则仪器的灵敏度和色谱峰型都达不到最佳效果。

2.3.2 液相条件的优化

本研究主要考察了5种流动相体系，分别为20 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈（A）、50 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈（B）、0.9%甲酸+20 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈（C）、0.9%甲酸+50 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈（D）、0.9%甲酸+50 mmol/L甲酸铵水溶液-0.9%甲酸乙腈（E）。高氯酸盐和氯酸盐不同液相条件对灵敏度的影响见图2。由图2可知，流动相中甲酸和甲酸铵含量对氯酸盐和高氯酸盐的色谱保留能力以及色谱峰型均有较大的影响。当甲酸铵水溶液浓度低于50 mmol/L，氯酸盐保留较弱，灵敏度较低；当甲酸铵水溶液中不添加甲酸，氯酸盐和高氯酸盐的灵敏度较低，色谱峰型较宽并有拖尾现象；当有机相中添加一定比例的甲酸会严重降低高氯酸盐的灵敏度。因此，通过优化选择0.9%甲酸+50 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈体系（D）作为流动相。通过对进样量的优化，最终选择1 μL为进样体积，满足方法的要求，同时有效的减少了样品对仪器的污染。

图2 高氯酸盐和氯酸盐不同液相条件对灵敏度的影响Fig.2 Effect of different liquid phase conditions on sensitivity of perchlorate and chlorate

2.4 基质效应

采用标准曲线比较法[23]，对婴幼儿配方奶粉前处理方法的基质效应进行评估。标准曲线A：用超纯水稀释，制成含高氯酸盐依次为0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L 的混合标准工作液，氯酸盐依次为1 μg/L、2 μg/L、μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L。标准曲线B：用不含氯酸盐和高氯酸盐的婴幼儿配方奶粉样品，按照样品前处理方法进行提取净化，用净化液配制同样质量浓度的系列标准曲线。由基质效应（matrix effect，ME）=斜率B曲线/斜率A曲线×100%计算，得到氯酸盐的ME为0.93%，高氯酸盐的ME为0.68%。结果显示，奶粉样品的基质效应为基质抑制，因此采用外标法定量存在误差。采用同位素内标法，同位素内标与待测目标物的色谱和质谱行为相近，可以补偿氯酸盐和高氯酸盐因基质效应影响引起的响应变化，以解决因基质效应造成定量不准的问题。

2.5 标准曲线和定量限

由表2可知，高氯酸盐和氯酸盐添加量为7.5～75.0 μg/kg和15～150 μg/kg时，线性关系均良好，标准曲线相关系数（R2）均大于0.99，定量限分别为7.5 μg/kg和15.0 μg/kg，可以满足定量分析的需要。

表2 高氯酸盐和氯酸盐的线性范围、线性方程、相关系数及定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient and quantitative limits of perchlorate and chlorate

2.6 方法回收率与精密度

通过筛选，在牛乳基婴幼儿配方奶粉和羊乳基婴幼儿配方奶粉两种基质空白样品上进行1倍定量限、2 倍定量限、10 倍定量限3个不同浓度水平加标实验，每个水平做6平行，计算每个浓度点6个平行的测定值的平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），具体的精密度与回收率实验结果见表3。由表3可知，精密度试验结果RSD在2.0%～8.7%之间，平均回收率范围为82.50%～98.5%。方法学结果表明，回收率及精密度均能达到分析测定的要求。

表3 方法回收率和精密度Table 3 Recovery and precision of the method

2.7 实际样品测定

利用本研究建立的方法对10批次市售的婴幼儿配方奶粉进行检测，氯酸盐检出4批，含量范围在15～43 μg/kg之间。高氯酸盐检出7批，含量范围为7.5～33.0 μg/kg。

3 结论

采用UPLC-MS/MS法同时测定串联质谱法同时检测婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐残留，婴幼儿配方乳粉氯酸盐和高氯酸的定量限均为7.5 μg/kg和15.0 μg/kg，高氯酸盐和氯酸盐分别在7.5 μg/kg、15.0 μg/kg、75.0 μg/kg和15.0 μg/kg、30.0 μg/kg、150.0 μg/kg 3个水平下的加标回收率为82.5%～98.5%，精密度试验结果的相对标准偏差为2.0%～8.7%（n=6）；该方法稳定、准确、灵敏度高，可用于婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐残留量检测。