罗哌卡因纳米粒的制备及镇痛研究

刘江，王艺娇，赵健辉，王雪梅，刘占军*（.华北理工大学药学院，河北 唐山 06320；2.唐山工人医院麻醉科，河北 唐山 063000）

罗哌卡因（ropivacaine，RVC）是一种新型酰胺类局部麻醉药，广泛用于各种临床手术和其他急性和慢性疼痛。RVC皮下注射的镇痛作用时间一般为6 h，为了延长镇痛时间，必须持续给药，增加了不良反应发生率和给药负担，为此开发长效且安全的局部麻醉药十分重要。

海藻酸钠（sodium alginate，SA）是一种水溶性的天然多聚糖，无毒，可降解，无免疫反应，生物相容性好[1-4]，适合应用为乳化增稠剂、稳定剂、乳化剂、抗原、酵素、微生物和基因的载体等[5]。SA具有较强的亲水性，但机械性能较差，载药量较低且存在药物突释，因此用作药用载体时需要对其进行修饰改性。

丙烯酸类均聚物和共聚物具有很好的生物相容性，广泛用作药用辅料，如肠溶包衣材料，缓释控释制剂中水凝胶型骨架材料和黏膜黏附片剂等[6]。聚甲基丙烯酸甲酯[poly（methyl methacrylate），PMMA]具有很强的疏水性，与疏水性药物具有亲和作用，在控释制剂或缓释制剂载体中适合用作疏水链段。SA与PMMA接枝纳米粒（nanoparticles，NP），可延长药物作用时间，促进药物吸收。

本研究拟采用RAFT法，在SA上接枝PMMA，然后负载RVC制备SA-g-PMMA纳米粒（RVC/SAg-PMMA NP），通过红外光谱、热稳定性及形态、粒径分布等考察其材料性能，研究载药、药物释放及在昆明小鼠体内的镇痛作用。

1 材料

1.1 试药

罗哌卡因盐酸盐（中国食品药品检定研究院，含量：94.5%，批号：100866-201302）；甲基丙烯酸甲酯（MMA）（分析纯，天津致远化学试剂有限公司，重蒸后使用）；SA（分析纯，天津市兴复精细化工研究所）；偶氮二异丁腈（分析纯，北京化学试剂公司）；N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，分析纯）（上海阿拉丁试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂）；三硫代碳酸二酯（根据文献自制[7]）；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 动物

昆明小鼠，雌雄各半，体质量（25±2）g [华阜康SCXK（京）2014-0004，华北理工大学动物实验中心购买]，自由进食、饮水（净化水），喂小鼠专用饲料。

1.3 仪器

Nano ZS90激光粒度分析仪（英国马尔文仪器公司）；EXSTAR series TG/DTA7200 热重分析仪（日本SII Nano Technology Inc 公司）；H-7650型透射电镜（日本Hitachi公司）；1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪（日本Shimadzu公司）；MD10-14型透析袋（截留相对分子量1400）（北京瑞达恒辉科技发展有限公司）。

2 方法及结果

2.1 SA-g-PMMA NP的制备

NP及SA-g-PMMA NP的制备结合文献方法进行改进[7-8]，基本步骤如下：SA按文献方法[9]降解，达到10～15 kDa。在反应器中依次加入1.6 g MMA，0.04 g三硫代碳酸二酯，0.003g偶氮二异丁腈和30 mL苯，通入N2除去反应器中的氧气，持续30 min，于70℃条件下反应20 h。于冰水混合物中冷却至室温，用丙酮沉淀出PMMA大分子链转移剂。以DCC为脱水剂，DMAP为催化剂，反应器中加入SA、大分子链转移剂、DMAP、DCC，在20 mL二氯甲烷中常温反应24 h。在丙酮中沉淀产物，干燥后得到SA-g-PMMA接枝共聚物。SA-g-PMMA接枝共聚物直接与适量纯净水混合，自组装成SA-g-PMMA NP。接近饱和的RVC盐酸盐中，在常温下，滴加氨水，直至稍过量，并不断搅拌，去离子水洗涤沉淀，在50℃恒温干燥，得到RVC游离碱。将SA-g-PMMA和RVC游离碱充分混合均匀，常温下溶于去离子水中，通过自组装得到RVC/SA-g-PMMA NP。

2.2 制剂的表征

2.2.1 红外光谱 采用KBr压片法：样品与光谱纯KBr研磨混合后，加压20 MPa，3 min后取出，室温条件下测定4000～400 cm－1光谱，结果见图1。SA-g-PMMA NPs出现特征吸收峰：1731.8 cm－1处为羰基C＝O的伸缩振动吸收峰。在SA上3328.7 cm－1为-OH伸缩振动吸收峰，286.9 cm－1为C-H伸缩振动吸收峰，1602.4 cm－1和1425.1 cm－1分别为COO－不对称和对称伸缩振动吸收峰，1158.5 cm－1和1011.9 cm－1为C-O-C（环）骨架振动[10]。在形成接枝物后，SA-g-PMMA NP上的各吸收峰值，因化学环境的变化都稍有变化，证明了PMMA成功接枝到了SA上。图1c为RVC/SA-g-PMMA NP，-OH吸收峰明显变宽，是由于RVC上的-NH和＝O与SA结合成氢键，其他吸收峰变化不大。

图1 红外光谱图Fig 1 FTIR spectra

2.2.2 热分析 样品的热重分析采用TGA仪器进行，样品从室温条件以10℃·min－1匀速升温至650℃，采用氮气保护。TGA曲线见图2。

图2 热重分析图Fig 2 Thermal gravimetric analysis

由图2可知，SA涉及3个不同失重区，初始重量损失区为25～112℃，这是由于存在水分，加热后水分失去；第二个失重区为246～347℃，是由于COO－基团的降解及CO2损失（脱羧）所致；第三个失重区为347～650℃，是由于SA主链降解所致。SA-g-PMMA纳米粒第一个失重区SA比SA-g-PMMA重量降低要多些，这是由于样品中的水分较多，PMMA链段在受热过程中比较稳定，在整个加热失重过程中不会发生化学变化。而载药纳米粒（RVC/SA-g-PMMA NPs）在失重过程中，前两个失重区比较趋势变化不明显，在第三失重区明显有更多重量损失，主要是因为RVC在较高温度下分解所致。

2.2.3 形态学观察 分别取SA-g-PMMA和RVC/SA-g-PMMA混悬液，适当稀释后用铜网制样，用2%磷钨酸溶液负染，于透射电镜下进行观察。两种纳米形态如图3所示，均为类球形，载药后的规整程度下降，分布也更分散，SA-g-PMMA和RVC/SA-g-PMMA的平均粒径分别为（165.2±3.4）nm和（287.3±5.6）nm。

图3 透射电镜图（30 000×）Fig 3 Transmission electron micrograph（30 000×）

2.2.4 粒径分布 负载RVC的纳米粒与空白纳米粒配制成0.1%（W/V）的溶液，超声10 min，使溶液中纳米粒均匀分散，利用动态光散射法（条件：633 nm、25℃、4 mW、He-Ne）进行测定，结果见图4。

图4 空白纳米粒（a）及载药纳米粒（b）粒度分布Fig 4 Size of blank SA-g-PMMA NPs（a）and RVC/SA-g-PMMA NPs（b）

测得空白纳米粒的平均粒径为（183.7±3.7）nm，多分散系数（PDI）为（0.238±0.016），如图4a，分布较为均一，表明在制备过程中只有SAg-PMMA一种材料，生成纳米粒条件简单，容易得到分布窄的纳米粒。测得载药纳米粒的平均粒径为（309.1±9.3）nm，PDI为（0.392±0.081），如图4b。载药后粒径分布变宽，且粒径大幅度增加，与载药后体积增加及粒子间发生聚集有关。

2.3 RVC的含量测定

2.3.1 色谱条件[11]色谱柱：Zorbax Eclipse SDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）-乙腈溶液（1∶1）；等度洗脱，柱温：25℃；检测器：DAD（190～600 nm）；检测波长：262 nm；流速：1 mL·min－1；进样量：20 μL。

2.3.2 标准曲线 精密配制RVC 8.98、13.47、44.9、67.35、112.25、134.7、168.38 μg·mL－1的对照品溶液。用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样，按照“2.3.1”项下色谱条件进行测定，以RVC质量浓度（C）对峰面积（A）进行线性回归，得到回归方程为：A＝6.343C＋5.391，r＝0.9995，表明质量浓度与峰面积在线性范围内线性关系良好。

2.3.3 方法学验证 测得RVC的HPLC图见图5。溶剂和空白SA-g-PMMA对RVC含量的测定不产生干扰，证明该方法的专属性良好。日内精密度、日间精密度、加样回收率及稳定性均符合分析的要求（RSD值均小于5%）。

图5 RVC的HPLC色谱图Fig 5 HPLC of RVC

2.4 载药量和包封率的测定

精密称取适量的载药纳米粒，用乙腈溶解于25 mL量瓶中，超声3 min（超声时每隔5 s超声5 s）后，用有机滤膜（孔径：0.1 μm）过滤，RVC含量按“2.3”项下HPLC法测定。按下式计算RVC载药量和包封率。

RVC载药量（%）＝（纳米粒中的RVC量/纳米粒的总质量×100）%；

RVC包封率（%）＝（纳米粒中的RVC量/投料RVC的总质量×100）%。

不同药品与纳米粒质量比对于载药量和包封率的影响如表1所示，当质量比较低时具有较高的包封率，但载药量低，随着质量比的增加，载药量增加。但质量比过高时会导致载药纳米粒的粒径增大[12-13]。综合考虑选择质量比为0.6时较好，载药量为（3.59±0.16）%，包封率为（94.1±2.7），粒径为（309.1±9.3）nm。

表1 载药量和包封率Tab 1 Loading capacity and encapsulation efficiency

2.5 体外药物释放的测定

使用透析袋法研究了RVC从SA-g-PMMA NPs的释放。准确称取载药SA-g-PMMA NPs和RVC各5 mg，分别加入pH为7.4的PBS缓冲液，配制成5 mL溶液，密封在透析袋中。将透析袋放入37℃恒温下装有0.5 L PBS（pH 7.4）的玻璃烧杯中，以100 r·min－1的速度搅拌。在预设的时间点，取出5 mL透析液，过滤，用HPLC测定RVC含量。同时，补充等体积的同温度的PBS缓冲液。结果如图6所示，纯RVC溶液中RVC的释放较快，在0.5 h内药物释放达80%以上。载药SA-g-PMMA NPs表现出持续释放行为，24 h释放药物不到50%，72 h接近80%。

图6 体外药物释放曲线Fig 6 In vitro drug release profile

2.6 小鼠体内镇痛实验

体内镇痛实验使用电刺激法[14]进行。剃掉小鼠的腹部鼠毛，用20 V和15 V电压分别刺激小鼠的预注射部位，以小鼠对电刺激的反应发出的嘶叫次数作为痛觉阈值，筛选合格小鼠，随机均衡分组，每组8只。将RVC/SA-g-PMMA NPs、RVC溶液（均含2 mg RVC），分别皮下注射到小鼠腹部，然后分别在给药前及给药后固定时间电刺激小鼠腹部，记录电刺激达到痛觉阈值的次数。如果一组中的所有小鼠没有发出高于阈值嘶叫次数，则表明镇痛效果为100%；如果一组中有一半的小鼠对电刺激发声，则意味着有50%的镇痛作用。如果一组中的所有小鼠对电刺激都高于阈值嘶叫次数，则表示镇痛效果为0%，无镇痛作用。结果如图7所示，RVC溶液在2 h内就完全失去镇痛作用，而RVC/SA-g-PMMA NPs在20 h后仍然保持50%以上的镇痛作用。

图7 小鼠体内镇痛时长曲线Fig 7 In vivo analgesia duration curve in mice

3 讨论

本实验采用RAFT法进行SA-g-PMMA NPs的制备，RAFT法最大的优点是可以根据分子设计需要改变接枝率的高低，相关的更深入研究还在进行中。纳米粒在自组装载药过程中，RVC进行碱化过程使其与疏水链段PMMA具有更好的亲和性能，在药物释放过程中达到缓释目的。本研究结果表明制备的纳米材料，具有较好的热稳定性，载药后能够达到延缓药物释放的目的，在小鼠体内能够延长镇痛时间。后期课题组还计划开展纳米接枝率对载药及缓释的影响，纳米材料的生物相容性等相关研究，以期为临床应用提供实验和理论基础。