健康人群中IgG类血型抗体高低效价间的肠道微生物差异

桑瑞瑞， 蒋 密， 戎瑞明,2,3， 周 蓉*

1. 复旦大学附属中山医院输血科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海 200032 3. 上海市器官移植重点实验室，上海 200032

ABO血型系统是人类认识最早且最为普遍的血型分类系统。ABO血型系统的研究促进了现代输血医学的发展，并对器官移植排斥反应及母儿血型不合溶血病发病机制及疾病防治的研究起到重要推动作用。在ABO血型系统中，ABO血型抗原仅由遗传基因决定，但是影响ABO血型抗体效价的因素是极其复杂的。人群中ABO血型抗体效价高低不一。当进行ABO血型不相容器官移植的术前处理或发生母儿血型不合溶血病等其他相关疾病时，临床上往往需要通过血浆置换来降低ABO血型抗体效价[1-2]，这不仅增加患者的医疗负担，而且治疗效果也因人而异。因此，阐明影响ABO血型抗体效价的关键因素，进而帮助提高临床治疗效果是急需解决的科学问题。

在人体未经输血、妊娠或注射抗原的情况下，人血清中存在的抗体能天然地与其自身红细胞所缺乏的A、B抗原相对应，即在A型血人体中存在抗B抗体，同样情况下在B型血人体中存在抗A抗体，O型血人体中存在抗A抗B抗体。ABO血型抗体主要为IgM类和IgG类。相较于IgM类抗体通过B1淋巴细胞介导，无需抗原刺激，“自发地”产生[3-4]，IgG类血型抗体的产生仍然是有争议的。有研究[4-5]发现，介导适应性免疫的B2淋巴细胞受到生物界中细菌或食物表面的类血型抗原的刺激而产生IgG类血型抗体。人红细胞膜上的ABH抗原决定簇是一类比较简单的寡糖，在生物界非血型抗原体所特有，有些细菌表面也有类似的糖链结构[6]。因此，这些细菌具有与人红细胞ABH相同的抗原活性，而且这些细菌广泛分布于环境中，甚至存在人体肠道内，并不断给B2淋巴细胞以类A类B抗原的刺激，从而产生ABO血型IgG类抗体[6-7]。

与人体共生的微生态系统包括口腔、皮肤、泌尿和胃肠道，以肠道微生态系统最为主要、最为复杂。肠道微生态系统由肠道微生物及其所生活的环境共同构成，肠道微生物是其核心部分。肠道微生物由约1 000种细菌和其他物种(如病毒、古细菌、真菌等)组成，其中最常见的是厚壁菌门(51%)和拟杆菌门(48%)[8]，其余1%的细菌属于其他门，例如变形菌门(尤其是革兰阴性和埃希杆菌属)、放线菌门(尤其是革兰阳性和双歧杆菌属)、梭杆菌门(革兰阴性)、螺旋体门(革兰阴性)、疣微菌门(革兰阴性)和黏胶球形菌门(革兰阴性)[9]。Springer等[7]调查了282种革兰阴性菌，其中137种菌株中检测到A、B和/或H抗原活性(49%)，例如E.coliO86和B组抗原，并将E.coliO86喂给O型血和A型血志愿者，导致抗B抗体效价的特异性升高。也有研究[10]指出，进行肠道手术患者的血型抗体效价升高8～32倍，可能是由于手术时肠道微生物暴露引起的。因此，肠道微生物中很大可能存在携带有A、B和/或H抗原活性的菌株，从而刺激B2淋巴细胞产生IgG类抗A和/或抗B抗体。目前，不同肠道微生物的物种组成和丰度是否影响ABO血型抗体效价，仍然是未知的。研究[11]发现接受长期肠外营养的幼儿中ABO血型抗体效价低，特别是抗B抗体。这可能是由于肠胃外营养本质上是“无菌的”，并导致粪便菌群丰度降低和改变[12]，从而对B2淋巴细胞的刺激减少。

本研究通过比较健康人群中O型血IgG类血型抗体效价高低水平的肠道微生物的物种组成和丰度，探讨影响IgG类抗体效价水平的关键菌群。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2020年1月至2020年2月招募43例复旦大学在校学生为健康志愿者。纳入标准：(1)体检健康人群；(2)年龄18～30岁；(3)体质量指数(body mass index，BMI)18.5～23.9 kg/m2；(4)复旦大学在校学生。排除标准：(1)孕妇或生理期；(2)AB血型；(3)经常出差；(4)有输血史；(5)精神疾病；(6)取样前3个月内服用过抗生素或益生菌素片；(7)严重营养不良、感染、吸毒、吸烟或酗酒成瘾者；(8)有家族遗传病史、有肿瘤病史；(9)3个月内有严重腹泻或便秘；(10)有胃肠道手术史；(11)1个月内因疾病服用过含碱式水杨酸铋、Pepto-Bismol、Kaopectate、Maalox Total Relief Bismatrol、Pink Bismuth、Stomach Relief、Stress Walgreens Soothe和其他类似铋碱式水杨酸盐的药物；(12)有自身免疫性疾病者，服用免疫抑制剂患者；(13)过敏性肠综合征、炎症性肠病、肠易激综合征、持久性、传染性胃肠炎、结肠炎或胃炎、持续或慢性腹泻的病因不明、艰难梭状芽胞杆菌感染(复发)、幽门螺杆菌感染(未治疗)、慢性便秘、历史性的胃或肠道溃疡/胃肠道出血、腹痛、消化不良、胃肠里急后重(下坠)或排便困难、胃肠道息肉/包块/发育不良或癌症、腹泻或传染性胃肠炎；(14)合并严重的心脏、脑、肝、肾和造血系统疾病或其他严重的原发疾病。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(B2019-285)。

1.2 ABO血型抗体效价检测方法 采集志愿者静脉血4～5 mL，采用抗人球蛋白凝胶卡测定志愿者IgG类血型抗体效价。采用巯基试剂2-Me裂解其中的IgM类抗体，再将处理后的血清经连续倍比稀释后与表达检测目标抗体对应抗原的试剂红细胞反应，以受检血清凝集试剂红细胞的最高稀释倍数的倒数作为受检血清中检测目标抗体的效价。

1.3 样本分组标准 根据《ABO血型不相容亲属活体肾移植临床诊疗指南(2017版)》[13]和新生儿发生溶血病的抗体效价临床临界点[14]作为参考，将IgG类抗体效价的检测结果分为高低组，分别是IgG类抗A抗体效价低水平组(OALG,抗体效价≤128)；IgG类抗A抗体效价高水平组(OAHG,抗体效价≥256)；IgG类抗B抗体效价低水平组(OBLG,抗体效价≤128)；IgG类抗B抗体效价高水平组(OBHG,抗体效价≥256)。

1.4 粪便样本的采集 志愿者排净小便后将粪便排入干净的盛便器内，用一次性采样勺将新鲜样品转移至采样管中，每管2 g，立即冻存于-80℃冰箱备用。收集43例样本,将O型血样本送往北京市诺禾致源科技股份有限公司进行16S rRNA V3-4区域测序分析。

1.5 16S rRNA测序数据分析 测序得到的原始数据，存在一定比例干扰数据。首先对原始数据进行拼接、过滤，进而得到有效数据，然后基于有效数据进行Operational Taxonomic Unit(OTU)聚类和物种分类分析。根据OTU聚类结果，一方面对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对OTUs进行丰度分析，以得到样本内物种丰富度和均匀度信息、不同样本或分组间的共有和特有OTUs信息等。通过对肠道菌群进行α多样性、β多样性和线性判别分析(LEfSe，LDA阈值设为2)，比较ABO血型抗体效价高低组间群落结构的差异。

1.6 统计学处理 采用SPSS 25.0进行统计学分析，组间比较采用t检验和非参数检验，检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 健康人群ABO血型IgG类抗体效价分布情况 结果(表1)显示：43例志愿者中A型血12例，B型血17例，未发现抗体效价≥256的样本。O型血14例，抗体效价≥256的样本8例。由于在A型血和B型血人群中未发现高水平抗体效价样本，因此接下来只送检O型血志愿者的粪便样本。

表1 IgG类抗体效价的分布情况 n=43

2.2 肠道菌群的α多样性分析 结果(图1A)显示：稀释曲线出现平台期，提示样本测序深度达标。α多样性指数(图1B)表明：血型效价高低组间(OAHGvsOALG、OBHGvsOBLG)在属水平上Shannon指数差异无统计学意义(P=0.4111、0.2278)。Veen图(图1C)显示：OAHG组和OALG组共有的OTU个数为943个，OBHG组和OBLG组共有的OUT个数为745个。无论是OALG组还是OBLG组，特有的OUT个数均远高于高水平效价组。

图1 各组肠道菌群的α多样性分析

2.3 菌群结构β多样性分析 采用主坐标轴分析(PCoA)考察血型效价高低组肠道菌群β多样性的差异。结果(图2)显示：样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落差异很大的样品则会远远分开。

图2 基于OTU丰度的PCoA分析

2.4 肠道菌群结构分析 根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35(Top35，分组的丰度为组内所有样品的平均丰度)的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样本2个层面进行聚类，绘制成热图(图3A、3D)。在对OALG组和OAHG组的LEfSe分析中(图3B)发现：有17个菌群的相对丰度在2组之间显示出明显差异。在OAHG组中观察到细菌(包括梭状梭菌、脆弱类杆菌、未分类的酸杆菌科、嗜盐菌属、泥渣梭菌、优杆菌属、肠球菌、气单胞菌目、未分类的菌属、产碱杆菌属、古氏类杆菌、未分类的丙型变形菌目、伯克氏菌科、毛螺菌科和普通拟杆菌)的丰度增高，主要集中在拟杆菌属、梭菌属和未分类菌属，LDA分值>4的有毛螺菌科和普通拟杆菌，而Alistipesonderdonkii和华德萨特菌的丰度降低。在对OBLG组和OBHG组的LEfSe分析中(图3E)发现：有13个菌群的相对丰度在2组之间差异明显。在OBHG组中观察到细菌(包括多枝梭菌、毛螺菌科_1_4_56FAA、瘤胃球菌属_sp_W22、拟杆菌属_sp_4_1_36、梭菌属_sp_AT4和毛螺菌属)的丰度增高，主要集中在厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门，LDA分值>4的有毛螺菌属，而细菌(Muri菌科、红蝽菌纲、红蝽菌目、普雷沃氏菌科未确定菌属、青春双岐杆菌、革兰阴性菌纲和Selenomonadales)的丰度降低。

图3 基于菌群丰度的鉴定组间差异菌群

3 讨 论

本研究发现O型血清IgG类抗A/B抗体效价显著高于B/A型血清IgG类抗A/B抗体效价(P<0.001)。IgG类抗A/B抗体能够通过母体胎盘，当母婴血型不合时，胎儿或者新生儿可能会发生新生儿溶血病,且发病率与母体IgG类抗A/B效价正相关,一般认为只有当抗体效价≥128时,才有可能使新生儿发生溶血病[14]。临床上通常以1∶128作为临界值, 如果母亲血清中IgG类抗A/B抗体效价≥256时，提示婴儿很可能受害;如果母亲血清中IgG类抗A/B抗体效价≥512时,发生率在80%以上，必须进行临床预防性治疗[15]。因此本发现能对O型孕妇容易发生新生儿溶血病作出较好的解释。

本研究通过对比O型血IgG类抗体效价高低水平组的肠道微生物的结构和丰度，发现高低水平组的肠道微生物在属水平上菌群多样性(Shannon指数)差异无统计学意义，这可能是因为本研究的研究对象均为O型血，人类ABO血型通过微生物表面的血型抗原影响肠道菌群的组成[16]。但是通过LEfSe分析发现，高低水平组的肠道微生物菌群丰度存在显著性差异。在对比属水平上各菌群丰度时，本研究发现相比于OALG组，在OAHG组中毛螺菌科和普通拟杆菌富集。相比于OBLG组，在OBHG组中毛螺菌科富集。因为本研究对象为O型血人群，可以排除由于A/B血型抗原在肠黏膜层表达，充当肠道微生物的结合位点或碳源，导致肠道微生物菌群丰度的差异。由此推测可能由于这2种菌群本身或其代谢物具有类A/B抗原特性从而导致IgG类抗A/B抗体效价升高。菌群本身携带的抗原或代谢物是否与血型IgG类抗体生成有关还需进一步研究。此发现为接下来的机制研究提供切入点。

综上所述，本研究以肠道微生物为重要突破口，创新性提出肠道微生物影响ABO血型抗体效价。不再是研究某一种细菌对ABO血型抗体效价的影响，而是从宏观层面阐明在肠道微生态中，微生物组成及其丰度与血型抗体效价高低的关系，并且提出O型血中，血型效价高低水平间，在属水平上肠道微生物菌群多样性差异无统计学意义，但是在某些菌群的相对丰度上差异有统计学意义。这对阐明影响ABO血型抗体效价的关键因素提供一条新的科研思路，也可能会成为从根本上降低血型抗体效价的一种干预方法。