肝局灶性结节增生患者血浆miR-21的表达及鉴别诊断价值

胡 捷， 张翔宇， 王 征*， 周 俭,2*

1. 复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科，复旦大学肝癌研究所，教育部癌变与侵袭原理重点实验室，上海 200032 2. 复旦大学生物医学研究院，上海 200032

肝脏局灶性结节增生(focal nodular hyperplasia，FNH)是一种常见的肝脏良性占位，是先天存在的血管畸形导致的肝细胞异常排列，异常排列的肝细胞被纤维板层分隔并围绕在中心瘢痕周围[1]。

近年来，随着影像学技术的不断提高及体检的逐渐普及，FNH的报道有所增加，但一部分FNH病例缺乏典型的影像学表现，与肝腺瘤(hepatocellular adenoma, HCA)及肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)较难鉴别。FNH不是肿瘤性病变，也无恶性转变倾向，定期随访即可。而HCC是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率在我国恶性肿瘤中居第四位，死亡率却居第二位[2]。根治性手术切除是治疗HCC最有效的方法之一。HCA虽是一种良性肝肿瘤，但存在恶变和破裂出血的风险，因此也应尽早手术切除。因此术前准确的诊断对于手术决策具有重要意义。

FNH、HCA和HCC均可表现为动脉期的强化，在影像学表现上具有一定的重叠性。临床上通过乙肝背景及甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平可鉴别大部分HCC。但是仍有约40%的HCC患者AFP阴性，这部分HCC患者通过影像学、病史与一些不典型的FNH较难鉴别。MiR-21是一种在肝癌组织中高表达的促癌miRNA[3-4]，也有研究[5-6]发现肝癌外周血中也高表达miR-21。本研究探讨血浆miR-21在FNH病例中的表达及其对FNH、HCA和AFP阴性HCC的鉴别诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2018年3月至2020年8月复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科收治的FNH患者61例、HCA患者20例、AFP阴性HCC患者142例，共223例。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)接受外科手术切除；(3)具有完善的临床病理资料；(4)所有病例术后标本均经2位有经验的病理医生进行组织病理学诊断。排除标准：(1)AFP>20 ng/mL的HCC病例；(2)术前接受过抗肿瘤治疗的肝癌病例；(3)病理诊断为混合性肝癌的病例。另纳入在我科体检且未发现肝脏实性占位性病变、无其他恶性肿瘤病史的患者100例为对照组。所有样本均具有完备的AFP、异常凝血酶原(des-γ-carboxy prothrombin，DCP)检测数据，肝癌样本具有详细的肿瘤学特征资料。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会审查(B2019-090)，所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 血浆miR-21的检测 血浆样本在静脉采集血液后4 h内离心分离，以避免溶血导致的细胞内miRNA释放。所有样本采用两步离心法收集血浆：首先1 300×g离心20 min去全血中的细胞成分，然后14 000×g离心10 min去除可能残存的细胞碎片。收集的血浆样本与保存液(JUSBIO SCIENCES, 上海, FD05059)混合后置于-80℃深低温冰箱保存。采用实时定量反转录聚合酶链式反应法(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，real-time qRT-PCR)定量检测miRNA，严格按照试剂盒(JUSBIO SCIENCES, 上海, HCC9655)操作说明书进行。同时检测血浆miR-1228的表达作为定量的内参照[7]。

1.3 靶基因预测及信号通路分析 通过检索miRNA靶基因预测数据库(TargetScan，miRDB和ENCORI)，取三者交集，鉴定潜在靶基因，并通过DAVID数据库对潜在靶基因进行KEGG信号通路富集分析。

2 结 果

2.1 一般资料分析 结果(表1)显示：共纳入323例，男性235例，女性88例。其中FNH患者61例，平均年龄34.9岁，77.1%的患者为单发肿块，平均肿块大小为3.8 cm。AFP阴性HCC患者142例，平均年龄61.1岁，单发肿瘤109例(76.8%)，平均肿瘤大小为3.9 cm，97例(68.3%)患者无微血管侵犯，中国肝癌分期(China liver cancer staging，CNLC)为Ⅰ期的110例(77.5%)，Ⅱ、Ⅲ期为32例(22.5%)。HCA患者20例，平均年龄42岁，单发肿瘤占95%，平均肿瘤大小为3.6 cm。无肝占位的对照组100例，平均年龄为55.5岁，均经彩超检查以排除肝脏实性占位。

表1 入组病例的基本临床信息

2.2 血浆异常凝血酶原和miR-21的表达 结果(图1A)显示：DCP在AFP阴性HCC患者中的表达显著高于其他3组，在FNH和HCA组间差异无统计学意义。结果(图1B)显示：血浆miR-21在对照组和FNH患者中的表达水平相似，差异无统计学意义(P=0.103)。而HCA患者中血浆miR-21的表达显著高于FNH患者(P<0.001，倍数差异=2.03)和对照组(P<0.001, 倍数差异=1.78); AFP阴性HCC患者血浆miR-21的表达在4类人群中最高，是FNH人群的2.43倍(P<0.001)，HCA人群的1.21倍(P=0.351)。相关性分析(图1C)表明，血浆miR-21的表达与其他临床病理参数无相关性。

图1 DCP和血浆miR-21在4组患者中的表达差异

2.3 miR-21的靶基因预测及信号通路分析 结果(图2)显示：共鉴定出167个潜在靶基因，这些靶基因大多聚集在MAPK、Ras、TGF-β等促细胞增殖的转导通路。

图2 miR-21的功能分析

2.4 血液学指标鉴别FNH的效能分析 结果(表2、图3)显示：miR-21在区分FNH与AFP阴性HCC的AUC为0.914，特异度为92.3%，灵敏度为75.4%。而区分FNH与HCA的AUC为0.806特异度为50.8%，灵敏度为100%。进一步按临床治疗决策分组，miR-21区分无须手术的FNH病例和需要手术的病例(HCC和HCA)AUC为0.900，特异度为75.4%，灵敏度为88.9%。以上鉴别诊断的准确度均优于DCP。因miR-21的灵敏度较高，而DCP的特异度较高，将miR-21和DCP联合应用可进一步提高鉴别诊断的准确度。

表2 血液学分子标志物的鉴别诊断效能分析

图3 血液学指标鉴别FNH与AFP- HCC的ROC分析

3 讨 论

FNH是发病率仅次于肝血管瘤的第二大肝脏良性占位。尽管FNH与肝硬化有相似的病理学特征改变，但FNH无肿瘤相关基因突变，不会进展为HCC。有研究表明，FNH发病率为0.3%～3%，好发于年轻女性(男女比例为1：8)[8]，但FNH的发生并不依赖于激素[9]。本研究显示，FNH平均年龄为34.9岁，显著低于HCA(42.0岁)和HCC病例(61.1岁)。绝大多数FNH病例是在体检时意外发现，患者无特殊症状。

大部分FNH与HCC可通过增强CT或者MRI进行鉴别诊断，但临床上也有一些非典型的FNH，因其内部出现脂肪沉积，出血或钙化导致动脉期不均匀强化(与HCC类似)。同时，小于3 cm的FNH无中心瘢痕，使得其与HCC或HCA在影像学上较难鉴别。许多FNH因误诊或无法判断性质而选择了手术切除或介入治疗，给患者带来不必要的手术创伤；而一些AFP阴性的HCC患者也会因为误判为FNH从而错失最佳手术时机。因此，术前准确鉴别出占位性质，对治疗方式的决策以及患者预后的改善具有重要意义。有学者[10]试图采用肝脏弹性超声来鉴别FHN与HCA，该研究共纳入88例患者(其中65例FNH, 23例HCA)，通过肝脏弹性超声区分2类患者的平均AUC只有0.68，准确度较差无临床实用价值。而采用肝胆特异性MRI造影剂Gd-BOPTA或Gd-EOB-DTPA可显著提高FNH的诊断准确度[11-12]，但临床应用常受限于造影剂昂贵、MRI预约周期较长以及造影剂过敏等因素，无法常规开展。本研究基于血液学指标miR-21来鉴别不典型FNH与AFP阴性的HCC，AUC达0.914，诊断特异度为92.3%，灵敏度为75.4%，具有低成本、检测方便迅速等优点和极高的临床应用价值。

miR-21是一种促癌miRNA，在肝癌、结直肠癌等多种肿瘤中均高表达[13]。miR-21可通过调控PTEN/PI3K/AKT等信号通路促进肿瘤的增殖[14]，是一种潜在的分子标志物。而外周血循环miR-21在FNH和HCA病例中的表达目前尚无研究报道。本研究发现血浆miR-21在FNH病例和无肝脏占位的对照人群中表达相似，在HCA患者和AFP阴性的HCC患者中表达显著升高。信号通路分析显示，miR-21的靶基因多集中在肿瘤相关信号通路或增殖相关通路。结果提示血浆miR-21可准确地将无需手术治疗的FNH和需要手术切除的HCA和AFP阴性HCC区分开来。纳入的62例FNH中13例为非典型FNH(术前增强MRI倾向恶性肿瘤)，采用miR-21和DCP联合指标进行鉴别，其中10例可获得正确的判断，从而避免有创的手术治疗。

综上所述，本研究首次探讨血浆miR-21在FNH病例、HCA病例及AFP阴性HCC病例中的表达情况，为临床肝肿瘤的鉴别及治疗方式的选择提供了新思路，但是也存在一些不足，HCA及FNH发病率相对较低，因此样本量偏小；另外，肝癌样本局限为乙肝背景，与国外丙肝及酒精肝引发的肝癌存在一定差别；本研究为单中心研究，仅采用了中国汉族人群作为研究对象，研究结果仍需国际多中心研究进一步证实。