82种中草药及其复方对花鲈源维氏气单胞菌的体外抑菌效果

王宝屯， 颜远义， 毛 灿， 冯 娟， 邓益琴， 苏友禄,3*

(1. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心， 上海 201306； 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所∥农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室， 广州 510300； 3. 仲恺农业工程学院健康养殖创新研究院， 广州 510225； 4. 广东省畜牧技术推广总站， 广州 510500)

维氏气单胞菌(Aeromonasvernoii)在水环境中普遍存在，是一种人、兽、水生动物共患病菌，夏秋季节繁殖速度快，会引起宿主胃肠道、伤口及软组织感染，导致败血症[1].维氏气单胞菌能够感染包括草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[2]和大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[3]等多种养殖鱼类，给水产动物养殖业带来较大危害.鱼用疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗等.近年来，有关维氏气单胞菌疫苗在鲤鱼(Cyprinuscarpio)[4]中已有报道，具有较好的保护作用，但目前鱼用疫苗从研发到成功获得生产批文难度较大.使用抗生素仍是目前对抗养殖鱼类维氏气单胞菌感染的有效方式，然而使用抗生素会带来一系列的负面问题：(1)病原菌会对抗生素产生耐药性，导致治疗效果变差[5]；(2)抑制水体益生菌生长，进而影响整个水环境的生态平衡；(3)抗生素被水产动物吸收后，部分抗生素会残留体内，造成潜在食品安全和公共卫生安全[6].

花鲈(Lateolabraxmaculatus)，也指中国花鲈，俗称海鲈，是我国养殖产量最高的海产鱼之一，年产量超过15万t. 目前，广东、山东、浙江和福建等省份已形成规模化养殖[7]. 广东省珠海市花鲈养殖面积约20.7 km2，年产量超过12万t，占全省80%以及全国50%左右[8]. 而水产养殖病害的发生会影响其产业的发展，哈维弧菌(Vibrioharveyi)[9]和杀鱼爱德华菌(Edwardsiellapiscicidas)[10]等是花鲈的重要病原，对花鲈造成一定的危害.

水产动物病害绿色防控是渔业产业可持续发展的必然趋势. 中草药作为天然药物，在我国历史悠久，具有副作用小、残留少等优点，不仅能防治水产细菌病害，对病毒和寄生虫也具有良好的抑菌作用，还能促进水产动物生长发育并增强自身免疫力，提高成活率[11-12]. 农业上中草药可作为杀菌剂防治植物病害[13]，而水产上以中药为主的动物体外杀菌剂开发较少. 目前，已有研究[14]结果显示，部分中草药对罗非鱼(Oreochromisniloticus)源维氏气单胞菌具有体外抑菌作用，但仍需评价更多的单方及复方中草药对维氏气单胞菌体外抑菌效果.

本课题组对花鲈进行流行病学调查发现，维氏气单胞菌是花鲈养殖过程中的重要病原菌，能够引起花鲈内脏肿大、腹腔出血等临床症状[15]. 本研究选取成本低廉的常见绿色中草药，测定82种单方中草药对花鲈源维氏气单胞菌体外抑菌作用并设计7种复方组合，初步探究单方及复方中草药对维氏气单胞菌的体外抑菌效果，旨为后续筛选抗花鲈维氏气单胞菌中草药提供数据支撑.

1 材料与方法

1.1 供试中药、菌株来源、实验耗材

维氏气单胞菌18BJ181分离自广东省珠海市花鲈养殖场. 营养琼脂固体培养基、营养肉汤液体培养基经121 ℃灭菌后保存. 供试中草药购自广东省珠海市斗门区佰信医药(表1).

1.2 中草药原液制备

选取成本低廉的常见绿色中草药，置于60 ℃烘干后粉碎处理，称取100 g单方中草药，用纱布包裹，置于烧杯中，加入500 mL蒸馏水，室温浸泡2 h，武火煮沸后转文火煎煮30 min，重复2次后，将所得药液合并浓缩至100 mL，即浓缩后中草药质量为1 000 mg/mL，121 ℃高温灭菌后，置于4 ℃保存备用[16].

复方中草药按照质量比1∶1进行配比，分别称取中草药50 g，纱布包裹煮沸2次，合并浓缩滤液至复方中草药质量为1 000 mg/mL，121 ℃高温灭菌后，置于4 ℃保存备用.

1.3 维氏气单胞菌悬液制备

维氏气单胞菌18BJ181在营养琼脂培养基上划线培养24 h，挑取单菌落于营养肉汤培养基，28 ℃、200 r/min过夜培养，用麦氏比浊管调节菌浓度为1×108cfu/mL，作为实验菌液.

1.4 药物敏感性测定

参照潘吉脉等[17]的方法测定药物敏感性，取维氏气单胞菌悬液0.1 mL，均匀涂板于营养琼脂培养基，用提前高温灭菌并冷却的孔径为7 mm打孔器打孔，每个培养基均匀打4个孔，设置3组生物学重复及1组阴性对照，实验孔加入0.1 mL中药原液；28 ℃正置培养24 h，以3个不同角度测定抑菌圈直径. 判断标准[18]：抑菌圈直径<10 mm，为低度敏感(+)；抑菌圈直径10～15 mm，为中度敏感(++)；抑菌圈直径15～20 mm,为高度敏感(+++)；抑菌圈直径 >20 mm，为极度敏感(++++)，无抑菌圈为不敏感(-).

表1 供试中草药清单Table 1 The list of Chinese herbal medicines in the experiment

1.5 单方中草药最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)测定

参照夏与晴等[16]的方法测定中草药对维氏气单胞菌的最小抑菌质量浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC). 每种药物准备10支12 mL试管，依次编号. 无菌条件下将药物在1～8号管依次2倍稀释8个质量浓度梯度，1～9管分别加入10 μL菌悬液，即第9管为不加药只加菌的阳性对照，第10管为不加药不加菌的阴性对照，设置3组生物学重复，为了便于观察，同时设置1组不加菌的药物稀释组. 28 ℃、200 r/min培养24 h，肉眼观察结果. 无菌生长管澄清透明，药物最低质量浓度管为MIC.

选取MIC左右适宜质量浓度涂板，28 ℃培养24 h，观察是否长菌，无菌生长的质量浓度即为该种药最小杀菌质量浓度(Minimum Bactericidal Concentration, MBC).

1.6 复方中草药MIC和MBC的测定

根据单方中草药对维氏气单胞菌的药敏实验结果，选取药敏实验结果较好的中药进行复方试验，测定不同复方中草药对维氏气单胞菌的MIC和MBC，具体步骤参照1.5. 根据彭练慈等[19]方法测定复方中草药联合抑菌指数(Fraction Inhibitory Concentration Index，FICI)=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC. 判定标准：FICI≤0.5，判为协同作用；0.52，判为拮抗作用.

2 结果与分析

2.1 82种单方中草药对维氏气单胞菌的体外抑菌效果

维氏气单胞菌对36种单方中草药具有敏感作用，其中维氏气单胞菌对乌梅极度敏感(++++)，抑菌圈直径为21.44 mm；对苏木、五倍子、丁香和艾叶高度敏感(+++)，抑菌圈直径在15～20 mm；对黄岑等18种中草药中度敏感(++)，抑菌圈直径在10～15 mm；对大黄等13种中草药低度敏感(+)，抑菌圈直径小于10 mm(表2). 对柏子仁(Platycladusorientalis)等46种中草药不敏感.

表2 单方中草药对维氏气单胞菌体外抑菌效果Table 2 The bacteriostatic effect of single Chinese herbal medicine on A. vernoii in vitro

续表2

2.2 复方中草药对维氏气单胞菌的体外抑菌效果

复方中药中，维氏气单胞菌对乌梅+丁香复方极度敏感(++++)，其抑菌圈直径为22.50 mm；对乌梅+五倍子、五倍子+丁香、苏木+五倍子、苏木+丁香和乌梅+苏木复方高度敏感(+++)，抑菌圈直径在15～20 mm；对艾叶+丁香复方中度敏感(++)，抑菌圈直径为14.63 mm(表3).

表3 7种复方中药对维氏气单胞菌体外抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of 7 kinds of compound Chinese herbal medicines on A. vernoii in vitro

2.3 单方中草药对维氏气单胞菌MIC和MBC

乌梅、苏木、黄岑的MIC为15.60 mg/mL，MBC在31.25～62.50 mg/mL；五倍子、分心木、绵茵陈的MIC为31.25 mg/mL，MBC在31.25～62.50 mg/mL；丁香等6种中草药的MIC为62.50 mg/mL，MBC在62.50～125.00 mg/mL；艾叶等7种中草药的MIC为125.00 mg/mL，MBC在125.00～500.00 mg/mL；防风等4种中草药的MIC和MBC在250.00～500.00 mg/mL(表4).

2.4 7种复方中草药对维氏气单胞菌MIC和MBC

不同复方中草药对维氏气单胞菌的MIC和MBC不尽相同. 乌梅+五倍子和乌梅+丁香复方抑菌效果较好，MIC为15.60 mg/mL，MBC在32.25～62.50 mg/mL，2种复方组合的联合抑菌指数(FICI)在1～2之间，二者相互作用为无关效应；乌梅+苏木、苏木+五倍子、五倍子+丁香和艾叶+丁香复方MIC为31.25 mg/mL，MBC在62.50～125.00 mg/mL；前2种复方组合相互之间为拮抗效应，五倍子+丁香复方组合为无关效应，艾叶+丁香复方为相加效应；苏木+丁香复方的MIC为62.50 mg/mL，MBC为125.00 mg/mL，二者之间为拮抗效应(表5).

表4 单方中药对维氏气单胞菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度Table 4 The minimum bacteriostatic concentration and minimum bactericidal concentration of single Chinese medicines on A. vernoii

表5 复方中草药对维氏气单胞菌最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

3 讨论

中草药在水产病害防控领域应用范围越来越广，具有“绿色防控”水产病害的作用. 目前，中草药对不同来源维氏气单胞菌的体外抑菌实验已有研究. 细菌对药物的敏感程度和药物抑菌和杀菌效果可能与药物中活性成分有关. 细胞膜是细菌的屏障，对细菌具有保护作用，当细菌细胞膜被破坏时，细胞膜通透性增加，细菌内部电解质外漏，培养液的电导率增强.

乌梅提取物能够增强细菌电导率，可能是乌梅提取物能破坏细菌细胞膜，增强其通透性，电解质溶液外泄，电导率升高，胞外蛋白浓度增强，细菌失去其本身代谢和增殖活性[20]. 乌梅水提液对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophilia)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)抑菌效果较好，乙醇提取物对假单胞菌(Pseudomonas)和蜡样芽孢杆菌最小抑菌浓度为2.5～5.5 mg/mL[16,21]，推测乌梅中总酸度可能是影响抑菌作用方面之一. 在60 min, 超声频率100 kHz，体积分数95%乙醇：料液比为1(g)∶25(mL)的条件下，有机酸产出比率较高，为12.17%，对金黄色葡萄球菌(StaphylococcusAureus)和四链球菌(Micrococcustetragenus)等具有明显的抑菌作用[22].

苏木是传统活血化瘀中药，其活性成分苏木酮A(sappanone A)作用神经小胶质细胞靶蛋白IMPDH2的140位半胱氨酸位点，诱导其失活，进而抑制下游NF-kB等炎性信号通路，起到抗炎作用[23]. 苏木中分离的化合物苏木精(Brazilin)、3-去氧苏木酮(3-Deoxysappanone B)等对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有较强抑菌作用，苏木精与氨基糖苷类抗生素联合时对MRSA有协同作用，3-去氧苏木酮与庆大霉素联用呈现协同作用[24]. 五倍子对黄颡鱼维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌具有良好的体外抑菌效果[25]，富含五倍子单宁、酚类、鞣质、没食子酸等多种化合物，其甲醇提取物对大肠杆菌具有抑制作用，鞣质使细菌体内多种酶凝固，进而抑制细菌生长[26-27]. 与上述研究结果类似，本研究中乌梅、苏木、五倍子水提液对花鲈维氏气单胞菌具有较好的体外抑菌作用，推测可能是乌梅中的有机酸破坏细菌细胞膜进而影响细菌的代谢和增殖，苏木中某些化合物和五倍子中鞣质、没食子酸类等物质对体外抑菌效果发挥主要作用.

2种单方药组成的复方中药成分相对单一，可以通过药材均匀配比制备成供试样品[28]. 合理的设计复方中草药配伍可起到“协同”作用，增强中草药体外抑菌及杀菌效果. 在复方设计时，其种类及配比的不同，实验结果可能会造成一定的差异. 地榆+鹿衔草和地榆+姜厚朴(Magnoliaofficinalis)的复方组合对黄颡鱼维氏气单胞菌抑菌及杀菌不如地榆单方效果，2种复方组合MIC分别为15.60 mg/mL和31.25 mg/mL，MBC为125.00 mg/mL[29]. 本研究中乌梅+五倍子、乌梅+丁香复方组合对维氏气单胞菌体外抑菌和杀菌效果较好，MIC为15.60 mg/mL，MBC在15.60～31.25 mg/mL之间，除药物中的有效成分，中草药的煎煮方法，贮藏方式、产地等因素也会影响中草药药效的发挥.

中草药在水产养殖中应用较为广泛，具有天然、无毒、廉价、对鱼类和环境副作用小等优势，其可以添加到水环境中改善水质，也可以饲料添加剂提高水产动物免疫及抗病能力，激发鱼体非特异性的溶菌素等产生，从而增强鱼体非特异性免疫，对鱼体生长、免疫及抗病具有积极作用[30]. 水产养殖常见的饲料添加剂有大蒜(Alliumsativum)、芦荟(Aloevera)和黄芪(Astragalusmembranaceus)等，在分子水平上研究中草药的免疫激活作用已备受关注[31].有研究[32]发现，苏木提取物对金鱼(Carassiusauratus)具有较强的驱虫作用，且安全性好.石榴皮(Punicagranatum)和分心木(Juglansregia)中草药提取物能提高罗非鱼和鲤鱼的生长能力，同时增强对嗜水气单胞菌的抗菌作用[33-34].《中华人民共和国兽药典》颁布允许使用大黄五倍子散、清热散等多种中药应用于临床领域，对于乌梅等体外抑菌效果较好的中草药是否可以开发为临床兽药，仍需要系列的深入探究.

4 结论

在所测定的82种中草药中，仅38种对维氏气单胞菌呈现出一定的体外抑菌作用，乌梅、苏木、五倍子、丁香和艾叶的抑菌作用较强. 虽然复方组合中乌梅+五倍子和乌梅+丁香对维氏气单胞菌抑菌和杀菌效果较好，但联合抑菌指数分析显示它们呈现无关作用. 本研究结果表明：单方中草药乌梅和苏木水提液对花鲈源维氏气单胞菌均具有较好的体外抑菌和杀菌效果，可为后续的水产中药开发利用提供数据支撑.