低嘌呤、高纳豆激酶活性枯草芽孢杆菌SH21筛选及发酵条件优化

庞远祥,谢远红,金君华,刘慧,张红星

(北京农学院 食品科学与工程学院,食品质量与安全北京实验室,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京,102206)

纳豆激酶(nattokianse，NK)是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilisnatto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[1]，因可用于治疗血栓、高血压、阿尔茨海默氏病和玻璃体视网膜等领域而被广泛关注[2-9]。

食物中主要含有4种嘌呤，分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，而人体痛风是由于长期嘌呤代谢障碍、血尿酸升高引起组织损伤的一类疾病[10]。然而，多种NK冻干粉产品中均具有较高含量的嘌呤类物质，不利于痛风患者的食用。目前，对NK研究主要集中在具有高酶活性微生物的筛选[11]、新型酶的纯化以及特性研究[12-13]。因此，筛选出一种具有高NK酶活性、低嘌呤含量的发酵菌株，并在此基础上对其液体发酵条件进行优化，可为进一步开发高NK酶活性、低嘌呤产量的枯草芽孢杆菌发酵产品奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大酱,四川大凉山农户。

1.2 培养基

酪蛋白平板培养基(g/L)：酪蛋白胨20,葡萄糖5,K2HPO4·3H2O 1,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.1,琼脂15,pH 7.0,121 ℃灭菌15 min。

种子培养基、LB 培养基(g/L)：蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10(固体培养基加15 g/L 琼脂),121 ℃灭菌15 min。

初始液体发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨20,乳糖20,Na2HPO4·12H2O 5,NaH2PO4·2H2O 1,CaCl20.2,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,121 ℃灭菌15 min。

1.3 实验方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌的筛选

产NK菌株筛选：取1 g大酱,放入装有9 mL 无菌生理盐水的试管中振荡5 min,沸水浴加热10 min,10 000 r/min离心5 min,取上清液进行梯度稀释,以划线分离法将上清液涂布于酪蛋白平板上,放入恒温培养箱中,37 ℃培养24 h观察平板透明圈直径大小并进行测量,选取透明圈直径大者转接LB斜面培养。

摇瓶筛选：取初筛所得菌株接种于LB 培养基中,37 ℃,180 r/min 恒温培养12 h,接入液体种子培养基,37 ℃,180 r/min 恒温培养12 h。按2%(体积分数)的接种量将种子液接种至液体发酵培养基中,37 ℃,180 r/min 恒温培养24 h,测定发酵液NK酶活力及嘌呤含量。

1.3.2 NK酶活力及嘌呤含量测定方法

1.3.2.1 NK酶活力测定

采用酪蛋白消化法[14]测定发酵液中NK酶活力。

粗酶液制备：将发酵获得的菌液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min,取上清液经过0.22 μm膜过滤即为粗酶液。

酶反应：取1 mL粗酶液,加入2 mL 0.5%酪蛋白,混合均匀,40 ℃ 孵育10 min；加入3 mL 10% 三氯乙酸终止反应,8 000 r/min离心5 min。设立对照组,对照组为加入酶液前加入3 mL 三氯乙酸。

显色反应：取1 mL酶反应液,加入5 mL 0.55 mol/L NaCO3溶液和1 mL福林酚溶液,迅速混匀,40 ℃ 恒温水浴中显色20 min,测定吸光度(A680)。

酶活力定义：1 min内形成1 μg酪氨酸所需的NK剂量。

1.3.2.2 嘌呤含量测定

采用高效液相色谱法[15]对发酵液中的嘌呤含量进行检测。

前处理：取2 mL发酵上清液于25 mL具塞管中,加入2 mL 3 mol/L硫酸溶液,加塞后立即置于沸水浴水解10 min,冰浴冷却,调pH至2.0～8.0,定容至10 mL。再以0.22 μm针式过滤头过滤,即得待测样品,备用。

色谱条件：色谱柱：ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；流动相：A相,10 mmol/L乙酸铵,B相,乙腈；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；紫外检测波长：254 nm。

1.3.3 菌种鉴定

通过16S rRNA序列对菌株进行鉴定。采用TIANamp细菌DNA试剂盒提取总DNA。使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增。扩增程序如下：95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,退火温度55 ℃,复性30 s,72 ℃延伸5 min,进行34个循环。PCR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果经BLAST(NCBI)比对分析。

1.3.4 单因素试验

(1)培养基碳源优化：以初始培养基为基础,分别使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉和甘油为碳源,测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(2)培养基氮源优化：在现有优化基础上,分别使用胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和蛋白胨,测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(3)培养基接种量优化：以初始培养基为基础,将种子液以不同接种量(体积分数1%、2%、3%、4%、5%)接入发酵培养基中,测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(4)培养基初始pH优化：在现有优化基础上,改变发酵培养基的初始pH(5、6、7、8、9),测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(5)培养温度优化：在现有优化基础上,调整发酵温度(31、33、35、37、39 ℃),测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(6)培养时间优化：在现有优化基础上,调整发酵时间(24、36、48、60、72 h),测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

1.3.5 Plackett-Burman试验设计

在单因素试验的基础上,利用Design-expert软件进行n=12的 Plackett-Burman试验设计,其各因素与水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.3.6 最陡爬坡试验

爬坡试验依据 Plackett-Burman 试验结果确定各显著影响因素及正负效应,设定步长及变化方向,以快速逼近最佳区域。

1.3.7 Box-Behnken中心组合试验

利用最陡爬坡试验得出中心点,设计3因素3水平优化试验,采用Box-Behnken中心组合试验进行实验条件优化。试验设计的各因素与水平如表2所示。

表2 Box-Behnken design 试验因素与水平Table 2 Levels and factors of Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

酪蛋白平板筛选得到3株产透明圈菌株,摇瓶发酵分别测定其NK酶活力和嘌呤含量,SH21酶活力最高,嘌呤含量最低(表3)。

表3 三种菌株发酵液中纳豆激酶活性和嘌呤含量的比较Table 3 Comparison of nattokinase activity and purine of the three strains

对SH21进行PCR扩增,产生了一段1 378 bp的DNA片段。经BLAST比对,发现与枯草芽孢杆菌(Genbank：MK860024)和枯草芽孢杆菌(Genbank：KP717559)的16S rDNA基因序列具有100%的同源性,结合其形态和生理特性,SH21被鉴定为枯草芽孢杆菌(Genbank：MN756647)。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 最佳碳源的确定

不同碳源对NK酶活力及嘌呤含量的影响如图1-a所示。当碳源为葡萄糖时酶活力最高,为165.77 U/mL,嘌呤含量为91.54 mg/L；而碳源为蔗糖时嘌呤含量仅为43.01 mg/L,酶活力为134.04 U/mL,综合考虑选择蔗糖作为发酵培养基的碳源。

a-碳源种类对发酵产纳豆激酶和嘌呤的影响；b-氮源种类对发酵产纳豆激酶和嘌呤的影响；c-pH对发酵产纳豆激酶和嘌呤的影响；d-接种量对发酵产纳豆激酶和嘌呤的影响；e-温度对发酵产纳豆激酶和嘌呤的影响；f-时间对发酵产纳豆激酶和嘌呤的影响图1 各因素对酶活力以及嘌呤含量的影响Fig.1 The influence of various factors on enzyme activity and purine content

2.2.2 最佳氮源的确定

对于氮源而言(图1-b),酶活力最高为酪蛋白胨，其值达到160.07 U/mL。其主要原因在于前期筛菌时采用的氮源为酪蛋白胨,因此对菌株具有一定的驯化作用[16],故以酪蛋白胨为氮源时酶活力较为显著。而嘌呤含量虽以胰蛋白胨为氮源时嘌呤含量最低,但其相差不是很大,在21.78～39.33 mg/L之间,综合比较选取酪蛋白胨作为最佳氮源。

2.2.3 最佳pH的确定

pH对酶活力和嘌呤影响如图1-c所示。随着pH的升高,酶活力先上升后下降,而嘌呤先下降然后上升后下降。当pH为7时,酶活力最高,为119.19 U/mL,而嘌呤含量虽然以pH为9时其嘌呤含量最低,但其差异不显著,同时考虑到NK在中性条件下酶活力较为稳定[17],且该 pH 条件下适宜枯草芽孢杆菌的生长,故pH取7。

2.2.4 最佳接种量的确定

接种量在1%～3% 时,酶活力逐渐增加,嘌呤含量下降。当接种量大于3%,酶活性降低,嘌呤含量增加(图1-d)。接种量在1%～3% 时,随着接种量的增加,菌体繁殖速度加快,酶活也相应增加,当接种量大于3% 后,由于营养物质匮乏导致其生命活力逐渐降低,酶活力也相应降低[16]。故接种量设为3%。

2.2.5 最佳发酵温度的确定

温度对酶活力和嘌呤影响如图1-e所示。随着温度的提高,酶活力逐渐增加,在37 ℃时酶活力达到最大值(128.96 U/mL),此时嘌呤含量为45.77 mg/L,随后酶活力开始下降,嘌呤含量开始增加。故发酵温度设为37 ℃。

2.2.6 最佳发酵时间的确定

不同发酵时间对NK酶活力及嘌呤含量的影响如图1-f所示。在24～48 h时,酶活力逐渐增加,嘌呤含量逐渐下降。之后,随着时间增加,酶活力降低,嘌呤含量增加,推测发酵时间过长,菌体生长进入衰亡期,甚至产生自溶,使得大量DNA释放,导致酶活力下降,进而产生更多的嘌呤类物质[18]。因此最佳发酵时间为48 h。

2.3 Plackett-Burman试验结果与分析

试验结果见表4。由表5方差分析结果可知,酶活力模型的P值 0.001<0.05,模型选择正确。接种量、pH、发酵温度的P值均小于0.05,对NK酶活力影响显著,发酵时间对酶活力影响不显著；嘌呤模型的P值为0.010 6<0.05,模型选择正确,各变量P值均小于0.05,对嘌呤影响均显著。综合考虑选择接种量、pH和发酵温度进行下一步的优化。

表4 Plackett-Burman试验结果Table 4 Results of Plackett-Burman experiments

表5 方差分析结果Table 5 The results of ANOVA

2.4 最陡爬坡试验

以接种量、pH和发酵温度为自变量,各因素试验设计如表6所示。接种量2.5%,pH 6.5,发酵温度38 ℃时,酶活力最高,嘌呤含量最低。因此,以第4组试验水平作为 Box-Behnken中心点,进行优化试验。

表6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Design and results of steepest ascent experiment

2.5 响应面试验

2.5.1 试验设计及结果分析

表7 Box-Behnken design 试验结果Table 7 Results of Box-Behnken design experiments

方差分析结果如表8和表9所示。所选模型P值均小于0.01,差异极显著,说明回归方程模型具有高度显著性；失拟项P值均大于0.05,差异不显著,说明模型对试验拟合程度良好；相关系数R2均在0.9以上,可以预测实验结果。

表8 酶活力回归模型的方差分析Table 8 Variance analysis (ANOVA) of enzyme activity regression model

表9 嘌呤回归模型的方差分析Table 9 Variance analysis (ANOVA) of purine content regression model

2.5.2 模型预测与验证实验

利用Design-expert软件,分析3种显著因素(接种量、pH、温度)的响应面和等高线。预测得到发酵培养基最佳参数为接种量3%,pH 6.0,温度37.93 ℃,理论最高酶活力可达到202.53 U/mL,嘌呤含量最低为50.068 mg/L。考虑实际限制,将发酵温度调整为38 ℃。为了验证响应面分析的可靠性,利用上述最佳参数进行3次平行验证,实际测定酶活力为204.52 U/mL,嘌呤含量为51.27 mg/L,接近模型预测。

3 结论

通过两步法从大酱中筛选得到1株低嘌呤、高酶活力的枯草芽孢杆菌SH21,在单因素试验的基础上,利用 Plackett-Burman设计筛选得到pH、接种量和发酵温度这3个显著因素,利用 Box-Behnken 中心组合设计确定最优发酵条件,确定了优化后的发酵培养基为20 g/L蔗糖、20 g/L酪蛋白胨、5 g/L Na2HPO4·12H2O、1 g/L NaH2PO4·2H2O、0.2 g/L CaCl2、0.5 g/L MgSO4·7H2O；优化后的发酵条件为pH 6.0,接种量3%,发酵温度38 ℃,发酵时间 48 h,在此条件下,NK酶活力提高了1.22倍,嘌呤含量降低了32%,本研究提高了产酶水平并降低了生产成本,为开发高NK酶活性、低嘌呤产量的枯草芽孢杆菌发酵产品奠定研究基础。