纳豆冻干粉对2型糖尿病碱性磷酸酶与炎症反应的影响

王语聪,谢智鑫,张学艳,王英男,韩建春,

1(东北农业大学 食品学院,黑龙江 哈尔滨,150030) 2(黑龙江省绿色食品科学研究院,黑龙江 哈尔滨,150028) 3(东北农业大学医院,黑龙江 哈尔滨,150030)

我国2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)发病率呈现逐年递增趋势[1],目前普遍采用口服降糖药和注射胰岛素方法治疗和缓解T2DM,但长期使用会给人类身体健康带来不良影响。近年研究表明,糖尿病特征之一就是炎性反应,这与脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)增多有关。大量LPS进入血液循环后诱发炎症因子释放,进而引起炎症失衡,导致胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),最终诱发2型糖尿病,现已证明此作用为“代谢性内毒素血症”。肠道碱性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase,IAP)可以通过对LPS进行去磷酸化作用来保护细胞[2],从而降低炎症发生。有研究表明,在高血糖的T2DM患者的粪便中IAP水平与正常血糖的T2DM患者水平相似,说明血糖的高低或者抗糖尿病药物不会影响IAP浓度[3]。此外,BATES等[4]探究LPS和IAP之间控制肠道炎症水平的动态平衡反馈机制,研究LPS通过激活2条不同的途径诱导炎症(即NFκB和LPS依赖的TNF-α释放,后者通过TNF受体起作用),上调IAP基因转录的表达,IAP使LPS去磷酸化。去磷酸化的LPS不再能够触发TLR4刺激,甚至可能阻断该受体与完整LPS结合。当刺激加大后炎症相关基因的上调导致炎症和细菌跨黏膜通道的增加,细胞内IAP可阻止NFκB途径的2个关键蛋白磷酸化。总之,IAP通过在2个水平下调NFκB途径来控制炎症：通过减少LPS对TLR4的刺激和通过阻止NFκB转位到细胞核。因此,IAP与LPS呈负相关且对炎症反应具有保护作用。

纳豆(natto),又称“酱豆”,是一种大豆发酵食品,含有丰富的营养物质,例如各种有机酸和寡糖,同时还含有纳豆激酶、超氧化物歧化酶、异黄酮等多种生理活性物质。研究表明,纯化后的纳豆激酶能够激活并转化为溶纤酶来增强体内指纤维蛋白溶解活性,在治疗和预防常见的血栓疾病方面具有一定意义[5]。例如,王天琦[6]研究表明纳豆中的纳豆激酶可以抑制大鼠体内血栓的形成,并且纳豆激酶并未对小鼠自身产生伤害。除此之外,IWAI等[7]研究发现,纳豆表面黏稠部分分离出的水溶性成分(分子质量<100 kDa)和纳豆去表面的水提取物可以显著降低血浆低密度脂蛋白含量和肝脏及主动脉过氧化脂质含量。安秀峰等[8]通过MTT法探究纳豆脂肽对人乳腺癌细胞MCF-7的影响,结果表明纳豆脂肽能够抑制细胞的增殖,从而引起人乳癌细胞MCF-7凋亡。

上述研究指出纳豆及其成分具有溶血栓、抗肿瘤及抗氧化等药理作用[9],但对纳豆作为一种药食同源的物质,直接食用能否促进IAP活性及在糖尿病模型中IAP、LPS和炎症反应三者之间的关系至今仍不清楚。因此,本试验以T2DM大鼠为模型,通过灌胃纳豆冻干粉水溶液,检测大鼠体质量变化和血糖浓度变化,采用(meso scale discovery,MSD)多因子检测手段来探究粪便中IAP活力和LPS浓度,以及肠道中炎症因子水平白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-1β)、生长调节致癌基因α(KC/GRO)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-13(IL-13)的变化,探究纳豆冻干粉对糖尿病大鼠粪便中IAP和LPS的变化及与炎症反应的影响,为纳豆冻干粉在功能性食品开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

SPF级别SD雄性大鼠(150±20)g(合格证：No.1103241911038497),北京斯贝福生物有限公司；链脲佐菌素(streptozocin,STZ),美国Sigma公司；碱性磷酸酶试剂盒,碧云天生物技术有限责任公司；内毒素检测试剂盒,厦门试剂生物科技责任有限公司；Proinflammatory Panel 2(rat) Kits,Meso Scale Diagnostics LLC；AIN-93M标准饲料(NMF,总热能3 601 kcal/kg,10% 的能量为脂肪,14.1%的能量为蛋白质)、高糖高脂饲料(1.5% 胆固醇、0.25% 胆酸钠、10% 猪油、5% 蔗糖、83.25% 标准饲料),中国营养动物饲料高科技有限公司。

HERAEUS Multifuge X3R离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司；1300 MESO®QuickPlex SQ 120 MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT®微孔板、1300 MESO®QuickPlex SQ 120MSD读板机,Meso Scale Diagnostics LLC；I14698I血糖测定仪,强生医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及干预

将大鼠饲养于动物笼中,并保持(50±15)% 的相对湿度,于(22±2)℃和昼夜12 h条件下单笼饲养。所有的试验步骤遵循试验动物护理以及动物协议,由西安交通大学动物伦理委员会批准[10]。将大鼠分成4组(n=10)并投喂标准饮食及高糖高脂饲料。第1组正常对照组：未经处理,每日给予标准饲料饲喂并灌胃20 mL/kg超纯水；第2组模型组：建模成功后喂饲高糖高脂饲料并灌胃20 mL/kg超纯水；第3组纳豆冻干粉低剂量组：建模成功后喂饲高糖高脂饲料并每天灌胃20 mL/kg剂量为4 g/kg溶液;第4组纳豆冻干粉高剂量组：建模成功后喂饲高糖高脂饲料并每天灌胃20 mL/kg剂量为8 g/kg溶液。纳豆冻干粉低高剂量参考文献[11]。试验期间小鼠自由采食和饮水,每天早上8点定时灌胃,在建模成功后第4周处死并进行各指标检测。在适应性喂养后,开始建立T2PM大鼠模型。除正常对照组外,其余组均高糖高脂饲料喂养4周。将模型组和纳豆冻干粉剂量组给予30 mg/kg STZ腹腔注射(禁食12 h),继续喂养高糖高脂饲料；注射后第3 天和第7 天(禁食12 h),检测空腹血糖值,以大鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L视为模型建立成功[12-13]。进行称重并尾尖取血,测定其空腹血糖值(即0 h),给予2.0 g/kg BW 葡萄糖后测定0.5、1、2 h血糖值,即为空腹血糖值。在对STZ粉剂进行计算时,以30 mg/kg为计量标准,溶解于新鲜的柠檬酸钠缓冲液中(0.1 mol/L,pH 4.3)。为保证其特性,应现用现配,并避光保存。

1.2.2 纳豆冻干粉制备方法

豆经清洗后浸泡24 h,于121 ℃蒸煮30 min,降至室温后用手捏碎并均匀掺入质量分数10% 纳豆芽孢杆菌菌液,37 ℃发酵24 h后置于4 ℃后熟12 h,经真空冷冻干燥去除水分后于超微粉碎设备研磨获得纳豆冻干粉,活菌数为1.1×1011CFU/g[14]。

1.2.3 粪便采集及制备肠液

T2DM大鼠模型建成后,分别从各组中随机选取大鼠,通过腹部注射4 mL/kg,质量分数20% 乌拉坦(禁食8 h后)以麻醉大鼠,随后颈部脱臼处死大鼠,将处死后大鼠固定在超净工作台上,在其腹部正中进行剖腹解剖。按近胃部幽门处2～3 cm开始剪取一段肠道组织,所需组织经过在滤纸上吸取表面水分和污垢后称取0.2 g组织样本。将称量好的小肠组织放入呈有5 mL预冷PBS的组织匀浆器中,并将组织粉碎完全,立即装入15 mL离心管中、2 000×g离心10 min,吸取上清液并置于1.5 mL EP管中,-20 ℃冷冻保存。试验开始后采取2粒大鼠粪便,置于EP管中于-20 ℃储存,用于检测IAP和LPS含量。

1.2.4 大鼠体质量和血糖值检测

开始条件喂养后,每周进行尾静脉采血并用血糖仪测定空腹血糖,并测其体质量。

1.2.5 细菌内毒素测定

取少量粪便,按料液比1∶10(g∶mL)添加细菌内毒素检验用水,迅速3 000×g离心1 min收集上清液,利用试管定量显色基质法检测细菌内毒素浓度[15]。

1.2.6 碱性磷酸酶测定

取少量新鲜粪便,以1 mg粪便中加入50 μL PBS进行稀释。用旋涡法制备粪便匀浆悬液,通过离心(20 min,10 000×g)收集含IAP上清液,并根据碱性磷酸酶试剂盒说明书测定IAP活性。

1.2.7 MSD多因子检测炎症因子含量

利用MSD电化学发光检测技术,以SULFO-TAGTM为标记物。在MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT®微孔板电极表面通电后,电化学作用激发SULFO-TAGTM标记物发出强光,检测炎症因子含量[16]。

1.3 数据分析

本研究通过Excel、Graphpad Prism8、SPSS Statistics 20对数据进行整理分析。试验数据均表示为平均值±标准误差,采用t检验进行统计分析,P<0.05认为差异具有统计学意义,即差异显著,P<0.01为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 大鼠血糖变化

如表1所示,建模前血糖无显著差异(P>0.05),建模成功后的7和14 d时,与正常对照组相比,模型对照组有极显著升高(P<0.01)；与模型对照组相比,纳豆冻干粉剂量组均无显著差异(P>0.05)。在21 d时,与正常对照组相比,模型对照组有极显著差异(P<0.01)；与模型对照组相比,纳豆冻干粉剂量组显著降低(P<0.05)。在28 d时,与正常对照组相比,模型对照组极显著上升(P<0.01)；与模型对照组相比,纳豆冻干粉剂量组均显著降低(P<0.05)。

表1 纳豆冻干粉对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响Table 1 Effect of natto powder on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats

血糖是诊断T2DM最重要标准,血糖高低标志着T2DM病情改善情况。有研究表明,纳豆主要通过加强机体内抗氧化能力和免疫能力[17],并改善IR状况方式降低血糖,其中纳豆中多种活性成分包括大豆异黄酮、激酶等有降糖作用[18]。本试验研究结果表明,纳豆让T2DM大鼠降糖效果明显,与模型对照组相比差异显著。说明纳豆对T2DM大鼠有辅助降糖作用,高剂量组降糖效果更好,其可能原因为纳豆中含有能够降低小肠中α-葡萄糖苷酶的物质,从而减少对单糖的吸收[19]。

2.2 大鼠体质量变化

如图1所示,建模完成后,与正常对照组相比,模型对照组体质量均显著上升(P<0.05)；与模型对照组相比,各组之间差异不显著(P>0.05)。

图1 各组大鼠体质量随干预时间变化Fig.1 Changes in body mass of rats in each group with intervention time

在整个过程中,正常对照组大鼠活动正常,精神状态良好,色泽光亮；模型对照组大鼠不活泼,精神状态不好,被毛无光泽。纳豆冻干粉组大鼠精神好转,反应敏感度加大,颓废状态有所改善,活动变多,说明纳豆冻干粉缓解了T2DM带来的影响。建模成功后,模型对照组大鼠体质量低于正常对照组,正常对照组大鼠体质量有所增加,而模型对照组和纳豆冻干粉剂量组喂饲高糖高脂饲料后,体质量出现下降趋势,原因可能是高剂量STZ与高热量饮食联合[20],导致胰岛β细胞发生坏死,并致胰岛素分泌不足,进而使体内糖代谢絮乱,发生IR,大鼠摄取体内脂肪和蛋白质提供能量[21]。

2.3 粪便中IAP活性和LPS浓度变化

如表2所示,与正常对照组相比,模型对照组LPS浓度显著上升(P<0.05)；与模型对照组相比,纳豆冻干粉剂量组LPS显著降低(P<0.05)。在IAP方面,与正常对照组比,模型对照组极显著降低(P<0.01)；与模型对照组相比,纳豆冻干粉剂量组均显著升高(P<0.05)。

表2 纳豆冻干粉对2型糖尿病大鼠粪便中IAP和LPS影响Table 2 Effect of natto powder on IAP and LPS in fecal of type 2 diabetic rats

2.4 炎症因子含量测定

2.4.1 促炎因子含量变化

如图2所示,与正常对照组相比,模型对照组TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ均显著升高；与模型对照组相比,纳豆剂量组TNF-α、IL-6和IFN-γ均显著降低；在IL-1β方面,与模型对照组相比,纳豆低剂量组无显著差异(P>0.05),但高剂量组极显著下降(P<0.01)。

图2 纳豆冻干粉对小鼠肠液TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ浓度影响Fig.2 Concentration of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mouse serum of control and treatment groups

2.4.2 抗炎因子及趋化因子含量变化

如图3所示,与正常对照组相比,模型对照组IL-4、IL-5、IL-10和IL-13均显著下降；与模型对照组相比,纳豆剂量组IL-4、IL-5和IL-13均显著升高；在IL-10方面,与模型对照组相比,纳豆低剂量组无显著差异(P>0.05),纳豆高剂量组显著升高(P<0.05)；在KC/GRO方面,与正常对照组相比,模型对照组显著升高(P<0.05)；与模型对照组相比,纳豆高剂量组极显著降低(P<0.01)。

图3 纳豆冻干粉对小鼠肠液IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和KC/GRO浓度影响Fig.3 Concentration of IL-4,IL-5,IL-10,IL-13 and KC/GRO in mouse serum of control and treatment groups

3 结论与讨论

为进一步揭示纳豆冻干粉对T2DM作用机制,本试验建立了T2DM大鼠模型。T2DM主要体现胰岛素抵抗及胰岛素分泌不足。炎症与IR联系密切,被认为是导致IR发生根源,已有研究表明,肠道慢性炎症在T2DM发生和发展中发挥重要作用,肠道黏膜免疫发生絮乱,就会引起肠道炎症发生[22]。IAP是一种肠道刷状边界酶,其仅在近端小肠绒毛相关肠细胞中表达,可以作为肠道黏膜防御因子,维持肠道内环境稳定,保护宿主免受肠道炎症损伤，IAP可以使LPS脱磷酸从而降解LPS，降低其毒性，使其失去破坏性，从而解毒。肠道存在大量革兰氏阴性菌,其细胞壁主要成分是LPS,当肠道中LPS浓度过高时,会破坏肠道黏膜免疫系统,诱发肠道炎症发生。有证据表明,T2DM有利于内毒素(特别是LPS)在肠屏障中易位,导致血液中内毒素浓度轻微升高[23]。总的来说,高水平IAP对于T2DM有保护作用[24]。KLAAS等[25]首次发现LPS是IAP的作用底物,因此提出IAP可以降解LPS的假说。LALLS[26]研究结果表明,肠道中IAP和LPS存在负相关,当肠腔中IAP浓度增加时,对LPS作用增加,LPS毒性减少,降低肠道炎症。实验结果表明,纳豆冻干粉可增加T2DM大鼠粪便的IAP活性,同时降低LPS浓度。

IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ可以作为炎症反应调节因子,在炎症中发挥中心作用,当免疫因子被激活时释放,机体中其含量增加,引起损伤。有研究表明T2DM高血糖可以促进TNF-α浓度升高,TNF-α浓度过高会加速胰岛细胞破坏；高脂喂养的小鼠肠道中IL-6分泌增加,TNF-α表达升高[27]。INOOKA等[17]使用纳豆冻干粉饲喂肠道菌群失衡小鼠，发现小鼠免疫得到改善且肠道菌群得到保护，炎症因子TNF-α、IFN-γ分泌降低；曹靖文等[28]研究发现，纳豆菌糖肽能诱导小鼠腹腔巨噬细胞，从而使细胞中IL-1β、TNF-α表达受到抑制。本试验结果表示,纳豆冻干粉剂量组能够显著降低IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ浓度(P<0.05),与前人的研究相符合。其可能原因为促炎因子受到胰岛素抵抗后分泌速度加快,导致胰岛素细胞凋亡速度加快,因此,纳豆冻干粉可通过降低相关炎症因子浓度,从而缓解炎症,进而缓解T2DM。

IL-4是一种在Th2细胞中具有代表性的典型炎症因子,可以抑制炎症因子分泌,包括IL-6、TNF-α等。IL-5同IL-4一样在Th2细胞中发挥重要作用,可以缓解由嗜酸性粒细胞诱导的炎症效应,Th2细胞属于抗炎细胞,起到重要抗炎作用,可以使Th1介导炎症受阻[29]；IL-10属于抗炎因子,可以控制炎性反应发生,机体组织糖、脂肪代谢可以被IL-10调节,起到T2DM发生预防作用。IL-13可以使巨噬细胞活化受到抑制,减少炎性因子分泌,同时可以抑制炎症介质产生,又可以使B细胞增殖加快及分泌抗体,起到抗炎作用[30]。沈柱英等[31]在对免疫功能低下小鼠的免疫调节研究中发现,通过灌胃纳豆菌糖肽后,血清中IL-10含量显著升高,说明纳豆具有一定免疫增强作用。尚沁沁等[32]探究Caco-2细胞中细胞因子的影响,通过体外模拟实验表明,纳豆芽孢杆菌能够有效提升IL-10。本次实验结果表明,纳豆剂量组中大鼠肠道中IL-4、IL-5、IL-10和IL-13浓度与模型对照组有显著差异(P<0.05),与前人的研究结果相符。其可能原因是纳豆冻干粉刺激抗炎因子,使其表达量增加,从而抑制促炎因子的表达量,并升高抗炎因子浓度,缓解炎症反应。KC/GRO是趋化因子中的一种,推测其表达与细胞生长有关,与受体结合后可促进炎症反应[33]。本试验中纳豆冻干粉能够有效降低糖尿病小鼠肠道中KC/GRO,进而降低肠道中促炎症因子。其可能的原因是纳豆冻干粉降低LPS及炎症因子的浓度从而减少GRO的表达,进而有效改善T2DM。

有研究表明，肠道中IAP和LPS存在负相关，当肠腔中IAP浓度增加时，对LPS的作用增加，LPS所带毒性减少，由此引起的肠道炎症就会减轻[26]。本研究通过糖尿病模型大鼠实验研究发现,纳豆冻干粉可以维持血糖稳定,提高肠道中IAP活力,有效降低LPS浓度。通过大鼠肠道中抗炎因子、促炎因子及趋化因子水平进一步验证LPS可能引起的炎性反应。全面验证了IAP与炎症因子的关系,因此纳豆冻干粉能够有效改善T2DM的炎症反应,其作用机制可能是通过调节肠道中IAP活力刺激LPS浓度的变化调控来实现的。未来需要进一步研究纳豆冻干粉中主要成分在肠道黏膜中是如何调控参与改善机体炎症,缓解T2DM的发展。