血肿周围脑组织miR-340-5p、PDCD4表达水平与高血压性脑出血病人预后的关系

董 雨 张 山 武一平 祁红辉

积极明确高血压性脑出血后神经功能损伤的机制对疾病治疗、改善预后等均有重要意义[1，2]。有研究指出神经炎症在出血性脑损伤中具有重要作用[3，4]，而且多种微小核糖核酸（microRNA，miRNA）参与神经炎症发生、发展[5，6]。研究发现，miR-340-5p通过调节P38/MAPK信号通路改善大鼠脊髓损伤后神经炎症和细胞凋亡[7]。大鼠脑出血后血肿周围组织程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）表达上调，通过抑制Akt，促进神经元凋亡[8]。最新研究发现miR-340-5p靶向调控PDCD4对大鼠脑出血后脑损伤具有保护作用[9]。本文探讨血肿周围脑组织miR-340-5p及PDCD4的表达水平与高血压性脑出血病人预后的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集2016年9月至2020年9月手术切除的高血压性脑出血血肿周围脑组织217例，选择同期病理科尸检获取的正常脑组织标本50例作为对照。本研究获医院伦理委员会批准。

1.2 脑组织miR-340-5p和PDCD4 mRNA水平检测提取脑组织标本总RNA，参照反转录试剂盒（美国Sigma公司）说明书进行反转录反应，以U6作为内参。引物序列：U6上游引物5'-TACGGTAGCTAGCAAGCTA-3'，下游引物5'-CTAGCGAAGTGAGCGTAG-3'；miR-340-5p上游引物5'-TCGAAGTCGAACTGAGCTA-3'，下游引物5'-GACTAGAAGTCGAGCCTGA-3'；PDCD4上游引物5'-TCGAGAGCTGAGCGAGTGA-3'，下 游 引 物5'-TCAATGCGAAGCTGAGAG-3'。使用荧光定量PCR试剂盒（美国Sigma公司）进行荧光定量RT-PCR反应，反应参数：95℃、10 min预变性，95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、34 s，共计40个循环。

1.3 高血压性脑出血病人预后评估 发病90 d用改良Rankin量表评分评估预后，0～2分为预后良好，3～5分为预后不良。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行分析；计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用Pearson相关系数分析相关性；采用多因素logistics回归分析检验预后不良独立危险因素；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析评估效果；P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血肿周围脑组织miR-340-5p、PDCD4的表达水平及相关性 血肿周围脑组织miR-340-5p表达水平（0.67 ±0.14 ）明显低于对照组（0.77 ±0.15 ；P＜0.05 ），而PDCD4 mRNA表达水平（1.42 ±0.29 ）明显高于对照组（1.19 ±0.24 ；P＜0.05 ）。血肿周围脑组织miR-340-5p表达水平与PDCD4 mRNA表达水平呈明显负相关（r=-0.683 ，P＜0.05 ）。

表1 本文217例高血压性脑出血预后不良危险因素的单因素分析（例）

表2 本文217例高血压性脑出血预后不良危险因素的多因素logistic回归分析

2.2 血肿周围脑组织miR-340-5p、PDCD4的表达水平与预后相关性217例中，预后良好148例，预后不良69例。预后良好组血肿轴位脑组织miR-340-5p水平（0.70 ±0.13 ）明显高于预后不良组（0.62 ±0.10 ；P＜0.05 ），而PDCD4mRNA水平（1.38 ±0.20 ）明显低于预后不良组（1.51 ±0.24 ；P＜0.05 ）。

2.3 高血压性脑出血预后危险因素 单因素分析显示年龄、入院NIHSS评分、脑出血量、miR-340-5p水平、PDCD4 mRNA水平与病人预后有关（P＜0.05；表1）。多因素logistic回归分析结果显示，年龄≥70岁、入院NIHSS评分≥10分、脑出血量≥60 m l、miR-340-5p水平＜0.665 、PDCD4mRNA水平＞1.425 是预后不良的独立危险因素（P＜0.05；表2）。

图1 血肿周围脑组织miR-340-5p水平评估高血压性脑出血预后不良的ROC曲线分析

图2 血肿周围脑组织PDCD4 mRNA水平评估高血压性脑出血预后不良的ROC曲线分析

2.4 血肿周围脑组织miR-340-5p、PDCD4 mRNA水平评估预后的效果ROC曲线显示，血肿周围脑组织miR-340-5p水平预测预后不良的最佳截断值为0.665 ，曲线下面积为0.8 0 8 （9 5%置信区间0.7 3 3 ～0.882 ），灵敏度、特异度分别为7 0.97 %、71.0 5 %；PDCD4 mRNA的最佳截断值为1.425，曲线下面积为0.834 （95%置信区间0.775 ～0.894 ），灵敏度、特异度分别为71.08 %、68.35 %。见图1、2。

3 讨论

miRNA是非编码RNA的一种，多通过与靶基因mRNA 3'-UTR相应序列互补配对结合后产生负性调控作用。研究指出多种miRNA在神经元病理生理过程具有一定的调控作用[10～12]。研究发现miR-340-5p参与喉癌[13]、结肠癌[14]、肝癌[15]等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭。本文对高血压性脑出血血肿周围组织miR-340-5p、PDCD4 mRNA进行检测发现，miR-340-5p呈异常低表达，而PDCD4 mRNA表达水平明显升高。PDCD4是细胞凋亡过程中上调的基因。沈加兵等[8]研究指出PDCD4在大鼠脑出血后血肿周围区域表达上调，与神经元凋亡相关。本文相关性分析显示血肿周围组织miR-340-5p与PDCD4 mRNA表达水平呈负相关，提示高血压性脑出血血肿周围组织miR-340-5p低表达后负性调控PDCD4，促进神经元凋亡并加重病情。miR-340-5p对PDCD4产生调控的作用机制尚未完全明确，推测与miR-340-5p低表达后减少对凋亡执行分子caspase-3等抑制，间接导致PDCD4过表达并抑制Akt磷酸化，从而促进神经元凋亡[9]。

本文发现预后不良组血肿周围组织miR-340-5p的表达水平明显低于预后良好组，而PDCD4 mRNA表达水平则明显增高。提示miR-340-5p低表达负性调控PDCD4，导致PDCD4异常高表达，影响高血压性脑出血病人的预后。为进一步明确高血压性脑出血预后不良的危险因素，多因素logistic分析发现，miR-340-5p表达量≤0.665、PDCD4 mRNA表达量≥1.425、年龄≥70岁、入院NIHSS评分≥10分、脑出血量≥60 m l是高血压性脑出血临床预后不良的独立危险因素。大量研究已经表明高龄、入院NIHSS评分高、脑出血量大是脑出血病人预后不良的危险因素[16～18]。本文进一步经ROC曲线显示，血肿周围组织miR-340-5p水平≤0.665、PDCD4 mRNA水平≥1.425 对病人临床预后不良具有预测价值。这提示临床实践中可检测miR-340-5p、PDCD4 mRNA表达水平，初步预测治疗预后。

综上所述，高血压性脑出血后，血肿周围脑组织miR-340-5p表达减少，可能通过负向调控PDCD4参与脑损伤病理过程。血肿周围脑组织miR-340-5p、PDCD4 mRNA表达水平对发病90 d预后评估具有一定临床价值。