固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定海水中软骨藻酸

王九明, 陈军辉,2, 杨建勃, 何秀平,2*, 王愉宁, 王保栋,2

(1. 自然资源部第一海洋研究所, 自然资源部海洋生态环境科学与技术重点实验室, 海洋生物资源与环境研究中心, 山东 青岛 266061; 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室,海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266071)

近几十年来,随着人类活动和全球气候变化的加剧,近海赤潮灾害发生频率呈逐年上升趋势[1]。目前已知全球约300多种海洋赤潮藻中,至少有100种是产毒藻,而有毒赤潮暴发后会释放大量藻毒素,对海洋渔业生物造成严重危害,并且藻毒素易于通过食物链传递,进而威胁人类健康[2,3]。软骨藻酸(domoic acid, DA)是一种具有神经毒性的典型海洋藻毒素,具有较强的亲水性,是记忆丧失性贝毒的主要成分,主要由海洋硅藻拟菱形藻产生[4]。海洋环境中的DA不仅会毒害各类渔业生物,还会导致大型海洋哺乳动物及人类中毒,甚至死亡[5-8],例如DA曾引起美国大量海狮死亡[9],加拿大爱德华王子岛贝类中毒事件,最终导致4人死亡[4]。此外,当海水中DA浓度达到3.2 pmol/L时,斑马鱼胚胎心脏畸形率增加;当海水中DA浓度达到32.0 pmol/L时,斑马鱼胚胎死亡率增加并且会改变心脏基因的表达[10]。

对我国近海海域的伪装拟菱形藻(福氏拟菱形藻、尖细拟菱形藻、伪柔弱拟菱形藻和伪善拟菱形藻)进行分离纯化,均检测出了DA[11-13],由此可以看出,在我国海域中,能产生DA的有毒藻较多。近海海域又是海产养殖区密集分布地,海水中的DA将威胁海产养殖业的健康发展。因此针对近海养殖区海水中的DA进行有效监测尤为重要。

目前,用于海产品中DA检测的常用方法主要包括:高效液相色谱法[14]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[15]、酶联免疫分析法等[16]。其中,LC-MS/MS具有特异性强、准确度和灵敏度高等优点,是目前DA测定最常用的方法。近海海水中DA含量通常在ng/L水平[17,18],且高盐海水基质样品无法直接进行LC-MS/MS检测,因此需要对海水样品中的DA进行富集和净化。被动固相吸附法和固相萃取法(包括小柱和膜盘)是目前海水中DA富集的常用方法[3],被动固相吸附法已用于美国加利福尼亚沿岸海水中DA的富集检测[19],但该方法不能确定对海水中DA的富集倍数,致使无法对海水中DA进行准确定量。Wang等[20]采用反相C18固相萃取柱实现了20.0 mL海水中DA的富集,但通过增加海水上样量提高DA富集倍数时,DA回收率会明显下降。王九明等[18]利用固相萃取膜盘实现了海水中痕量DA的高效富集,富集倍数高达2 000倍,然而该方法需要消耗大量海水样品(2.0 L),并且整个处理过程有机溶剂消耗量大,操作过程复杂。

近十年来,在线固相萃取技术在水环境有机污染物快速检测领域应用越来越广,实现了微囊藻毒素[21]、除草剂[22]、多环芳烃[23]以及脂溶性海洋藻毒素[24]等有机污染物的快速检测。该技术具有所需水样少、有机溶剂用量少、自动化程度高、快速高效等优点,在水环境有机污染物日常检测和监测工作中具有广阔的应用前景[25,26]。迄今为止,采用在线固相萃取结合液相色谱-质谱联用技术快速富集检测海水中DA的研究鲜有报道,本文通过两种前处理模式,建立了检测海水中DA的分析方法,海水样品经酸化处理后,直接进行在线SPE-LC-MS/MS测定,适用于DA含量相对较高的海水样品测定;针对DA浓度较低的海水样品,先采用离线SPE富集、净化,然后结合在线SPE-LC-MS/MS对样品进行进一步处理和分析,以实现海水中超痕量DA的测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1 290 II超高效液相色谱仪(配有四元泵、二元泵、自动进样器(带大体积进样组件,最大进样量为900 μL)、柱温箱(带两位六通阀))、6470A三重四极杆质谱仪(配有喷射流电喷雾电离(ESI)源)、5 TC-C18(2)保护柱(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)和5 TC-C18(2)分析柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)(美国Agilent公司); Fotector Plus全自动固相萃取仪(睿科集团(厦门)股份有限公司); FA1104电子天平(上海精天电子仪器厂); Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司); RE100-Pro旋转蒸发仪(北京大龙公司); HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL,纳谱分析技术(苏州)有限公司); 0.22 μm混合纤维微孔滤膜(上海新亚净化器件厂)。

色谱纯甲酸和优级纯乙酸铵(瑞士Fluka公司);色谱纯甲醇和乙腈(美国Tedia公司); DA标准品(美国Sigma公司);实验用水为自制Milli-Q超纯水(18.2 MΩ·cm)。海水样品取自青岛近海。

1.2 标准溶液的配制

取1.0 mg DA标准品,用5%乙腈水溶液溶解,并定容至10.0 mL容量瓶中,得到质量浓度为100.0 mg/L的DA标准储备液,于-80 ℃避光保存。用5%乙腈水溶液对DA标准储备液逐级稀释,得到质量浓度为1.0 ng/L～1.0 mg/L的系列标准溶液,于-20 ℃避光保存。

1.3 实验条件

1.3.1离线固相萃取条件

移取经0.22 μm滤膜过滤的80.0 mL海水样品,加入0.32 mL甲酸进行酸化,以1.0 mL/min的流速通过HLB固相萃取柱(已用5.0 mL甲醇和超纯水活化,加载流速为1.0 mL/min),并使用5.0 mL超纯水进行淋洗,淋洗后利用氮气以160 mL/min的流速气推持续5 min;再采用10.0 mL甲醇洗脱DA,洗脱流速为1.0 mL/min;将甲醇洗脱液于50 ℃条件下旋蒸至近干,用0.8 mL 5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)复溶,并用0.22 μm滤膜过滤,待测。

图 1 在线固相萃取时六通阀切换示意图Fig. 1 Switch schematic diagrams of the six-way valve for on-line SPE systema. sample loading step; b. elution and analysis step.

1.3.2在线固相萃取条件

海水样品经酸化(加入海水体积0.1%的甲酸)或经离线固相萃取后,均可直接进行在线SPE-LC-MS/MS分析。使用5 TC-C18(2)保护柱(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)作为在线SPE柱进行DA在线富集,进样体积为0.6 mL,样品加载流动相为5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸),流速为1.0 mL/min。在线固相萃取六通阀切换示意图如图1所示,0～8 min时,六通阀为1-6位相通(见图1a); 8～20 min时六通阀切换至1-2位相通(见图1b); 20 min后六通阀切回1-6位相通。

1.3.3液相色谱-串联质谱条件

色谱柱5 TC-C18 (2)分析柱(150 mm×4.6 mm, 5.0 μm),柱温25 ℃,流动相(A)水和(B)90%乙腈水溶液(均含2.0 mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸),流速0.5 mL/min。梯度洗脱程序:0～8 min, 3%B; 8～18 min, 3%B～100%B; 18～20 min, 100%B。

离子源:ESI源、正离子模式,毛细管电压:4 000 kV;鞘气流速:11 L/min;鞘气温度:340 ℃;干燥气流速:7 L/min;干燥气温度:300 ℃;雾化器压力:310.6 kPa;多反应监测(MRM)模式;DA母离子m/z为312.1,碎裂电压130 V;子离子m/z分别为248.2(定性)和266.2(定量),碰撞能量分别为18 eV和16 eV。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

根据前期[18]研究结果,5 TC-C18(2)色谱柱对DA有良好的分离效果,因此本文采用5 TC-C18(2)分析柱用于DA的色谱分离。

甲醇水溶液[27]和乙腈水溶液[28]常被用作DA液相色谱分离的有机流动相,于是对90%甲醇水溶液(含2.0 mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸)和90%乙腈水溶液(含2.0 mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸)作为有机流动相时DA的LC-MS/MS分析结果进行了比较。如图2a所示,90%甲醇水溶液对DA有更强的洗脱能力,但目标物响应相对较低;90%乙腈水溶液作为有机流动相时,DA响应更高,具有更好的仪器检测灵敏度。由于DA在质谱中易生成[M+H]+母离子,流动相中酸性程度影响化合物离子化效率,进而影响方法的灵敏度。本文对流动相中添加不同体积分数甲酸(0.1%、0.2%、0.3%和0.4%)的效果进行了比较(见图2b),可以看出,甲酸体积分数为0.2%时,DA的响应最高。因此选择90%乙腈水溶液(含2.0 mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸)为有机流动相。

图 2 (a)不同有机流动相体系时DA的色谱图和(b)流动相中添加不同体积分数甲酸时DA的峰面积(n=3)Fig. 2 (a) Chromatograms of domoic acid (DA) with different organic mobile phases and (b) peak areas of DA with different volume fractions of formic acid in the mobile phase (n=3) Mobile phase in Fig. 2a: (1) 90% methanol aqueous solution (including 2.0 mmol/L ammonium acetate and 0.2% formic acid); (2) 90% acetonitrile aqueous solution (including 2.0 mmol/L ammonium acetate and 0.2% formic acid).

2.2 质谱条件的优化

采用ESI源分析DA,在正离子模式条件下DA易生成m/z312.2 [M+H]+特征离子峰,负离子模式下易生成m/z310.2 [M-H]-特征离子峰。但正离子模式条件下DA的检测灵敏度更高,因此选择在正离子模式下进行海水样品中DA的分析。

随后,在MRM模式下,对影响母离子(m/z312.2)和子离子丰度的两个主要参数破碎电压和碰撞能量进行了优化。破碎电压为130 V时,方法灵敏度最高;通过调节碰撞能量,选取DA二级质谱分析的最优子离子,以信号最强的子离子(m/z266.2)为定量离子,信号次强的子离子为定性离子(m/z248.2),并通过优化各离子对的碰撞能量,最终确定最优碰撞能量为16 eV(m/z266.2)和18 eVm/z248.2)。

2.3 离线固相萃取条件的优化

在离线固相萃取时,选择能高效富集DA的固相萃取柱至关重要。HLB固相萃取柱填料为聚乙烯吡咯烷酮聚合物,对极性和非极性化合物均有较好的富集效果,因此选择HLB固相萃取柱用于海水中DA的离线富集净化。因DA属于弱酸性化合物,在海水中易发生电离,不易于HLB固相萃取柱对其吸附,因此,可通过酸化海水样品抑制其电离,提高HLB小柱对DA的富集效率。海水加标样品(10.0 ng/L)添加不同体积的甲酸,海水酸化处理后DA的回收率明显提高,当甲酸的体积为0.32 mL时,HLB固相萃取柱对DA的吸附效率最高(见图3)。这与王九明等[19]采用磺化苯乙烯-乙烯基苯共聚物(SDB-RPS)固相萃取膜盘富集海水中的DA所添加的甲酸体积相一致。

图 3 不同甲酸体积对海水中DA回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of different formic acid volumes on the recoveries of DA in seawater (n=3)

2.4 在线固相萃取条件的优化

采用在线固相萃取用于水样中有机化合物的富集时,首先是选择填料类型合适、富集净化效果良好的富集柱。据相关文献[20]可知,反相C18填料的固相萃取柱可以富集海水中的DA,基于此,实验对4种不同填料的在线固相萃取柱进行了比较(见图4), 4种富集柱分别为美国Agilent公司的5 TC-C18(2)(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)、Zorbax Eclipse Plus-C18(12.5 mm×2.1 mm, 5 μm)、Zorbax Eclipse XDB-C8(12.5 mm×2.1 mm, 5 μm)和PLRP-S(12.5 mm×2.1 mm, 15～20 μm)柱。5 TC-C18(2)柱对DA有更好的保留能力,峰形较好并且质谱响应较高;DA在Zorbax Eclipse Plus-C18在线固相萃取柱上峰宽较窄,但质谱响应较低;DA在Zorbax Eclipse XDB-C8和PLRP-S在线固相萃取柱上会产生扩散现象,导致峰宽较宽。因此,实验选择5 TC-C18(2)柱作为测定DA的在线固相萃取柱。

图 4 不同在线固相萃取柱对DA保留能力的影响Fig. 4 Effect of different on-line SPE columns on the DA retention abilities

实验还考察了海水样品酸化处理对5 TC-C18(2)柱在线富集DA的影响,加入相对海水体积0.1%的甲酸时,DA的富集率最高、色谱峰面积最大,因此最终确定了加入甲酸的体积为海水体积的0.1%。

2.5 方法学考察

本文对两种检测模式下方法的基质效应(ME)、线性范围、灵敏度和回收率等进行了考察。

2.5.1基质效应评价

ME在LC-MS/MS分析中普遍存在,主要表现为对目标化合物的检测信号有增强或者抑制作用,从而影响目标化合物的定量准确度。ME=|基质溶液中DA的峰面积-纯水溶液中DA的峰面积|/纯水溶液中DA的峰面积。ME可分为3个等级:(a)0～20%,轻微影响;(b)20%～50%,中度影响;(c)大于50%，显著影响[29]。

本文分别采用超纯水和空白海水配制3个水平(20.0、80.0和300.0 ng/L)的DA加标样品,每个水平制备3个平行样品,通过在线SPE-LC-MS/MS和离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS测定比较,考察ME对检测结果的影响。在这两种检测模式下,平均ME分别为18.3%(低、中和高水平基质效应:19.7%、18.5%和16.7%)和13.7%(低、中和高水平基质效应:15.1%、14.2%和11.8%), DA质谱信号均受到轻微影响,因此在采用在线SPE-LC-MS/MS和离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS测定海水DA过程中可以忽略ME的影响。

2.5.2线性方程

将DA标准储备液逐级稀释,得到质量浓度分别为0.3、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0和500.0 ng/L的系列标准溶液,以DA的质量浓度(ng/L)为横坐标(x, ng/L)、定量离子峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线。在10.0～500.0 ng/L范围内,直接在线SPE-LC-MS/MS检测模式下的线性方程为y=7.431 1x+188.68(线性相关系数R2=0.999 2);在0.3～50.0 ng/L范围内,离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS检测模式下的线性方程为y=524.07x+163.87(R2=0.999 0)。结果表明这两种检测模式下线性范围内线性关系良好。

2.5.3检出限和定量限

在空白海水样品中加入低水平的DA标准溶液,分别采用两种检测模式考察方法的灵敏度,将DA信噪比(S/N)为3和10时所对应的质量浓度作为方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。海水样品直接采用在线SPE-LC-MS/MS测定,LOD和LOQ分别为4.0 ng/L和10.0 ng/L,已达到或优于表1所列文献中方法的灵敏度,能满足近海海水中DA的常规监测需求。离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS测定,方法LOD和LOQ分别为0.1 ng/L和0.3 ng/L,明显优于其他文献[18,30,31],可用于远岸海水中超痕量DA的测定以及开展海水中DA降解规律等对检测灵敏度要求较高的研究工作。

表 1 本方法与文献方法的比较

2.5.4回收率和精密度

取空白海水样品,采用标准加入法对方法的回收率和精密度进行考察。结果表明,直接采用在线SPE-LC-MS/MS测定低、中、高水平(20.0、100.0和300.0 ng/L)DA海水加标样品,每个加标水平制备6个平行样(n=6), DA的平均加标回收率分别为81.0%、83.5%和86.6%, RSD分别为4.2%、4.1%和3.8%,表明在该检测模式下方法回收率和精密度均良好。离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS测定模式下,方法的加标回收率在低、中、高(1.0、5.0和20.0 ng/L)水平下分别为69.2%、71.7%和78.5%, RSD分别为4.4%、4.3%和3.1%,说明两步固相萃取可满足海水中的DA有效富集,并且方法的精密度良好,满足实际海水中DA测定的准确度要求。

3 结论

本文建立了在线SPE-LC-MS/MS和离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS测定海水中DA的分析方法。海水样品经酸化处理后可直接进样分析,该方法操作简单,自动化程度高,节省溶剂,较小体积海水样品即可满足近海海水中DA常规监测的灵敏度要求。海水样品经离线SPE结合在线SPE-LC-MS/MS大体积进样分析,具有更低的灵敏度,可为大洋或极地海水中超痕量的DA测定提供可靠的技术支撑。另外,所发展的技术方法还可推进海水中DA检测方法相关标准的建立,为海水环境中限量标准的制定和毒理研究提供依据。