不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃微生物群落的影响

周俊华 周波 王启芝 周志扬 黄香 罗鲜青 黄丽霞 梁琪妹 何仁春 邹彩霞

摘要：【目的】明確不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对山羊瘤胃微生物多样性的影响，为青贮甘蔗尾叶在山羊养殖生产中的应用提供参考依据。【方法】选取72只平均体重24.5 kg的努比亚山羊，随机分为对照组（CK）及3个试验组（T1～T3），每组2个重复，每个重复9只。CK组饲喂自然青贮甘蔗尾叶的全混合日粮（TMR），T1组饲喂经植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌及鼠李糖乳杆菌处理青贮甘蔗尾叶的TMR，T2组饲喂经黑曲霉、枯草芽胞杆菌及米曲霉处理青贮甘蔗尾叶的TMR，T3组饲喂经枯草芽胞杆菌和乳酸片球菌处理青贮甘蔗尾叶的TMR。预试期7 d，试验期42 d。饲喂结束后基于Illumina高通量测序技术探究不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃微生物多样性的影响。【结果】从4个处理组努比亚山羊瘤胃液中最终获得的OUT数量排序为T3组（1637个）>T2组（1603个）>CK组（1576个）>T1组（1560个）;各处理组间的Chao1指数排序为T3组>T2组>T1组>CK组，但差异不显著（P>0.05，下同）;Shannon指数排序为T3组>T2组>T1组>CK组，其中T3组显著高于CK组和T1组（P<0.05，下同）;Simpson指数排序为T1组>CK组>T2组>T3组，各组间差异也不显著。在门分类水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是努比亚山羊瘤胃液中的绝对优势菌门，拟杆菌门相对丰度为57.50%～65.40%，以T1组的相对丰度最高;厚壁菌门相对丰度为14.39%～24.38%，T3组的相对丰度显著高于其他处理组;蓝藻菌门（Cyanobacteria）也表现为T3组的相对丰度最高。在属分类水平上，普雷沃氏菌属?1（Prevotella?1）是努比亚山羊瘤胃液中的绝对优势菌属，其对应的相对丰度排序为T3组>T1组>T2组>CK组，但组间差异不显著;未知属f型拟杆菌目RF16菌（Bacteroidales RF16 group_norank）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae UCG-001）和解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）的相对丰度均表现为T3组显著高于其他处理组。【结论】经枯草芽孢杆菌+乳酸片球菌处理的甘蔗尾叶青贮效果最佳，以其饲喂努比亚山羊可增加瘤胃微生物种群数量及多样性水平，进而提高努比亚山羊瘤胃降解粗纤维的能力及机体对非纤维性碳水化合物的消化能力。

关键词： 努比亚山羊;青贮甘蔗尾叶;瘤胃;微生物多样性;菌剂

中图分类号： S827;S816.53                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）02-0457-08

Abstract：【Objective】The objective of this study was to assess effects of sugarcane tops silage treated by different bacteria on rumen microbial diversity of Nubian goats， and provide reference for sugarcane tops silage application in goat breeding. 【Method】A total of 72 Nubian goats whose average weights were 24.5 kg were selected and randomly divided into four groups according to different microbial treatments of sugarcane tops silage in the diet：control group（CK）， treatment 1（T1）， treatment 2（T2）， treatment3（T3）， two replicates in each group， nine replicates in each replicate. Goats in the CK group were fed  total mixed ration（TMR） which used sugarcane tops silage. The T1 group was supplemented with sugarcane tops silage which added Lactobacillus plantarum， L. casei， L. fermentum and L. rhamnosus. The T2 group was supplemented with sugarcane tops silage which added Aspergillus niger， Bacillus subtilis and A. oryzae. The T3 group was supplemented with sugarcane tops silage which added B. subtilis and Pediococcus lactis. After feeding， the effects of different bacteria on rumen microbial diversity of Nubian goats were investigated based on Illumina high throughput sequencing technology. 【Result】Final OUT number from rumen fluid in four treatment groups of Nubian goats was ranked as T3（1637）> T2（1603）>C（1576）>T1（1560）;Chao1 index of four groups was ranked as T3>T2>T1>CK， but the difference was not significant（P>0.05，the same below）. Shannon index ranked as T3>T2>T1>CK， T3 was significantly higher than CK and T1（P<0.05， the same below）. Simpson index ranked as T1>CK>T2>T3， and there was no significant difference among them. At the phylum level， Bacteroidetes and Firmicutes were absolute dominant bacteria in Nubian goat tumor gastric fluid， the relative abundance of Bacteroidetes was 57.50%-65.40%， and that in T1 was the highest. The relative abundance of Firmicutes was 14.39%-24.38%， that in T3 was significantly higher than other groups. The relative abundance of Cyanobacteria was the highest in T3. At the genus level， Prevotella?1 was the absolute dominant bacteria， its relative abundance ranked as T3>T1>T2>CK， but there was no significant difference among them. The relative abundance of Bacteroidales RF16 group_norank， Prevotellaceae UCG-001 and Succiniclasticum in T3 were all significantly higher than other groups. 【Conclusion】The sugarcance tops silage which adds B. subtilis and P. lactis has the best effect. It can improve the microbial diversity and abundance of rumen microorganisms in Nubian goat， and improve the ability of rumen in Nubian goat to degrade the crude fiber and non-fibrous carbohydrate.

Key words： Nubian goat; sugarcane tops silage; rumen; microbial diversity; microbial inoculum

Foundation item： Guangxi Science and Technology Plan Project（Guike AB16380175）

0 引言

【研究意义】广西属亚热带气候，温、光、雨同季，非常有利于甘蔗生长及其糖分积累。甘蔗尾叶是甘蔗收获时的主要副产物，约占全株甘蔗的10%。据统计，广西甘蔗尾叶年产量达1400万t，但至今尚未开展大规模的甘蔗尾叶饲料化利用，绝大部分被遗弃焚烧（穆胜龙等，2017）。新鲜甘蔗尾叶可作为青绿粗饲料直接饲喂反刍动物，但新鲜甘蔗尾叶易脱水霉变，不便于长期保存，而造成资源浪费（Couto et al.，2017）。青贮可延长新鲜甘蔗尾叶的储存时间，提高其利用效率，同时青贮发酵可改善甘蔗尾叶的适口性及提高其营养价值（刘蓓一等，2019;周俊华等，2019）。瘤胃微生物对反刍动物的健康状况、生产效率及饲粮消化吸收等均具有重要意义，而动物日粮、养殖环境及基因型又影响瘤胃微生物的群落结构和功能特性。因此，借助基因組学和生物信息学方法探索日粮、饲养方式及养殖环境等对反刍动物瘤胃微生物的影响，对进一步调控瘤胃微生物及提高反刍动物生产具有重要意义。【前人研究进展】Muck等（2018）研究发现，乳酸菌可降低青贮过程中霉菌及其他有害微生物的存活率;布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）在青贮过程中可将糖酵解产生的乳酸转化成1，2-丙乙醇和乙酸，进而提高青贮饲料的好氧稳定性。穆胜龙等（2018）研究表明，植物乳杆菌（L. plantarum）和布氏乳杆菌均可提高青贮甘蔗尾的品质及有氧稳定性，且以植物乳杆菌的青贮效果更优。Sifeeldein等（2019）研究发现，甜高粱草接种从青贮象草中分离获得的嗜酸枝球菌（Mycococcus acidophilus）进行青贮，可显著改善其青贮品质，降低有害微生物数量、pH及氨态氮含量。Wang等（2019）研究发现，意大利黑麦草与燕麦接种嗜酸片球菌（Streptococcus acidophilus）进行青贮，可显著提高其干物质消化率和乳酸含量，降低pH及有害微生物数量，同时降低丁酸和氨态氮含量，进而提高青贮品质。唐振华等（2018）研究表明，以植物乳杆菌和布氏乳杆菌作为甘蔗尾叶青贮添加剂，可有效改善甘蔗尾叶的青贮品质。周俊华等（2019）研究报道，2.625×106 CFU/g黑曲霉（Aspergillus niger）+1.1×106 CFU/g乳酸芽孢杆菌两段式青贮可改善甘蔗尾叶的蛋白组分和碳水化合物组分。瘤胃微生物多样性决定了反刍动物机体的健康与生产性能，根据其功能可分为纤维素降解细菌、半纤维素降解细菌、蛋白降解细菌、淀粉降解细菌、脂肪降解细菌、利用酸菌和乳酸产生菌等（司丽炜和韩红燕，2020）。Seo等（2010）研究报道，瘤胃中的产乳酸菌可分泌乳酸，进而刺激乳酸利用菌的生长，促使瘤胃微生物适应乳酸积累环境，同时可维持瘤胃pH稳定。Uyeno等（2015）研究表明，反刍动物需利用瘤胃微生物发酵降解植物纤维，瘤胃内拥有充足的氮源及可发酵有机物，但只有二者比例适当时，瘤胃微生物合成的蛋白质才能有效维持机体正常生长并保证一定产奶量。马力等（2019）研究发现，不同物候期的牧草对瘤胃微生物多样性有一定影响，其中枯草期的瘤胃微生物多样性最高。赵娜等（2019）研究表明，饲喂青贮饲用油菜能保持育肥山羊瘤胃微生物菌群结构稳定。张智安等（2020）研究报道，在育肥湖羊饲粮中添加蜜蜂肽可增加瘤胃微生物群落丰富度和多样性。【本研究切入点】至今，有关青贮饲料对山羊瘤胃微生物群落结构特征及消化功能的影响已有较多报道（程宣，2018;赵梦迪等，2019;赵娜等，2019），但鲜见饲喂不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃微生物多样性影响的研究报道。【拟解决的关键问题】以不同菌剂处理的青贮甘蔗尾叶饲喂努比亚山羊，基于高通量测序技术探究不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶对山羊瘤胃微生物多样性的影响，为青贮甘蔗尾叶在山羊养殖生产中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验设计

选取遗传背景相近、体况良好的努比亚山羊72只，平均体重24.5 kg，按照体重相近原则随机分为4个处理组，分别为对照组（CK）及3个试验组（T1～T3）组，每组2个重复，每个重复9只。CK组饲喂自然青贮甘蔗尾，T1、T2和T3组分别饲喂经不同菌剂处理的青贮甘蔗尾叶（I、II和III）。新鲜甘蔗尾叶与菌剂混匀后，采用打包机制成袋装青贮，45 d后进行饲养试验。甘蔗尾叶青贮前处理方法见表1。

1. 2 试验日粮

参照肉羊饲养标准（NYT 816—2004）配制试验日粮，日粮组成：青贮甘蔗尾叶20.0%、花生秧20.0%、红枣粉10.0%、花生秧20%、玉米粉41.0%、碳酸氢钠1.0%、微量元素浓缩料8.0%，其中CK组、T1组、T2组和T3组所添加的青贮甘蔗尾叶分别为自然青贮甘蔗尾叶、青贮甘蔗尾叶I、青贮甘蔗尾叶II和青贮甘蔗尾叶III。饲粮配方及其营养水平见表2。

1. 3 饲养管理

饲养试验在广西扶绥广羊农牧有限公司生产基地开展。预饲期7 d，试验期42 d。试验期间采用全混合日粮（TMR）方式进行饲喂，每天按比例将各试验组精饲料与粗饲料混匀。采用舍饲方式，每天饲喂2次，饲喂时间为上午8：00和下午16：00，自由采食，自由饮水。

1. 4 样品采集

试验结束后，采用食道导管法采集晨饲前努比亚山羊的瘤胃液，将瘤胃液混匀，用无菌纱布过滤后分装于10 mL离心管中，-80 ℃冷冻保存备用。采集各处理组的日粮样品，经风干、粉碎过1 mm网筛后，储存于样品袋中，以备分析。

1. 5 瘤胃液细菌总DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）裂解缓冲液提取努比亚山羊瘤胃液总DNA（Sharma et al.，2003），并以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 6 16S rDNA序列PCR扩增及高通量测序分析

以无菌水稀释的总DNA（1 ng/mL）为模板、515F（5'-GTGCCAGCGCMGCCGCGG-3'）和970R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）为引物，PCR扩增16S rDNA序列V4～V5保守区片段。PCR反应体系30.0 μL： Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）15.0 μL，515F/970R引物对（0.2 μmol/L）2.4 μL，DNA模板10.0 ng，去离子水补足至30.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性1 min;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃结束反应。PCR扩增产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。选择大小在400～450 bp的序列条带，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（美国Axygen公司）进行回收纯化，然后依照测序量要求混合，利用Illumina MiSeq 250 bp/300 bp高通量平臺完成测序。

1. 7 生物信息学分析

原始数据样本区分与统计测序获得的原始数据以fastq格式保存，同时对序列质量进行质控和过滤;利用Usearch平台将有效数据按97%相似水平聚成一个分类操作单元（OTU）（Edgar，2013）。97%相似水平的OTU代表序列采用RDP Clsddifier v2.2进行分类分析（Wang et al.，2007），分别从门（Phylum）和属（Genus）分类水平研究样本的群落组成。使用QIIME v1.8.0进行Alpha多样性分析，采用R语言工具（v3.2.5）绘制稀释曲线（Rarefaction curve）及OTU分析Venn图等。应用Excle 2013对样本各微生物的相对丰度进行统计，并以SPSS 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 努比亚山羊瘤胃微生物的稀释曲线

如图1所示，4个处理组（CK、T1、T2和T3）12个样本（CK-1、CK-2、CK-3，T1-1、T1-2、T1-3，T2-1、T2-2、T2-3，T3-1、T3-2、T3-3）的瘤胃微生物稀释线均随测序通量的增大而趋于平坦，表明样本的高通量测序数据量合理，继续增加测序通量只会产生少量的新OTU。

2. 2 努比亚山羊瘤胃微生物Alpha多样性分析结果

基于Illumina高通量测序分析，CK、T1、T2、T3组最终获得的OUT数量分别为1576、1560、1603和1637个（图2）。4个处理组的共有OTU为1203个;CK组特有OTU为36个，T1组特有OTU为14个，T2组特有OTU为31个，T3组特有OTU为39个。Chao1指数表征群落物种丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映群落结构多样性。由表2可知，各处理组间的Chao1指数排序为T3组>T2组>T1组>CK组，但差异不显著（P>0.05，下同）;Shannon指数排序为T3组>T2组>CK组>T1组，其中T3组显著高于CK组和T1组（P<0.05，下同）;Simpson指数排序为T1组>CK组>T2组>T3组，各组间差异也不显著。4个处理组的覆盖率均在0.9900以上，说明所测样本16S rDNA序列被检测出的概率较高，可反映所测样本的真实情况。

2. 3 青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃菌门水平的影响

在门分类水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）在4个处理组努比亚山羊瘤胃液中均为绝对优势菌门（图3）。其中，拟杆菌门的相对丰度为57.50%～65.40%，以T1组的相对丰度最高;厚壁菌门的相对丰度为14.39%～24.38%，以T3组的相对丰度最高，且显著高于其他处理组（表4）。努比亚山羊瘤胃液中的优势菌门还包括蓝藻菌门（Cyanobacteria）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、Kiritimatiel-laeota、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）、互养菌门（Synergistetes）及软壁菌门（Tenericutes）等。蓝藻菌门也表现为T3组的相对丰度最高;纤维杆菌门则以T2组的相对丰度显著高于其他处理组;Kiritimatiellaeota、变形菌门（Proteobacteria）和螺旋体门（Spirochaetes）的相对丰度不存在组间差异。

2. 4 青贮甘蔗尾叶对努比亚山羊瘤胃菌属水平的影响

由图4和表5可知，普雷沃氏菌属?1（Prevotella?1）在4个处理组努比亚山羊瘤胃液中均为绝对优势菌属，其对应的相对丰度排序为T3组>T1组>T2组>CK组，但组间差异不显著。努比亚山羊瘤胃液中的优势菌属还包括F082_norank、理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae RC9 gut group）、未知属f型拟杆菌目RF16菌（Bacteroidales RF16 group_norank）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae UCG-001）、解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）、普雷沃氏菌科UCG-003（Prevotellaceae UCG-003）及Gastranaerophilales_no-rank等。其中，未知属f型拟杆菌目RF16菌、普雷沃氏菌科UCG-001和解琥珀酸菌属均以T3组的相对丰度最高，且显著高于其他处理组;F082_norank和Gastranaerophilales_norank的相对丰度不存在组间差异;普雷沃氏菌科UCG-003的相对丰度以T2组显著高于CK组和T1组，但与T3组差异不显著;理研菌科RC9肠道菌的相对丰度则以T1组显著高于其他处理组。

3 讨论

反刍动物瘤胃内拥有数量庞大且种类繁多的微生物系统，其多样性受诸多因素影响，尤其以日粮组成影响最显著（杨艳等，2020）。瘤胃为微生物的生长和繁殖提供有利环境，而微生物的种类及数量又反作用于瘤胃环境，进而对反刍动物的健康及生产性能起关键作用。周斐然（2017）研究发现，拟杆菌门、厚壁菌门及变形菌门是饲喂青贮甜高粱、青贮低糖高粱及青贮玉米奶牛瘤胃微生物的优势菌门;普氏菌属是饲喂青贮甜高粱或青贮玉米奶牛瘤胃微生物的优势菌属，Lachnospiraceae是饲喂青贮低糖高粱奶牛瘤胃微生物的优势菌属，说明饲喂不同青贮饲料会引起瘤胃微生物分类水平相对丰度的差异性。Indugu等（2017）研究发现，采食青贮玉米奶牛瘤胃的优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门，优势菌属为未分类的Bacteroidales、Bacteroidales RF16及普氏菌属，采食日粮不同是导致奶牛瘤胃细菌相对丰度在畜群间存在明显差异的主要原因。甄玉国等（2018）研究报道，添加米曲霉培养物及酵母培养物可增加绵羊瘤胃月形单胞菌属（Selenomonas）及梭菌属（Fusobacterium）等有益菌的数量。赵娜等（2019）研究报道，饲喂青贮饲用油菜对山羊瘤胃微生物门分类水平的相对丰度无显著影响，但显著提高普雷沃氏菌属?1及模糊分类群的相对丰度。

本研究结果表明，以不同菌剂处理青贮甘蔗尾叶饲喂努比亞山羊，其瘤胃微生物中拟杆菌门相对丰度为57.50%～65.40%，以T1组的相对丰度最高;厚壁菌门相对丰度为14.39%～24.38%，以T3组的相对丰度最高，且显著高于其他处理组;蓝藻菌门也表现为T3组的相对丰度最高;纤维杆菌门则以T2组的相对丰度显著高于其他处理组;Kiritimatiellaeota、变形菌门和螺旋体门的相对丰度不存在组间差异。在属分类水平上，普雷沃氏菌属?1在4个处理组努比亚山羊瘤胃液中均为绝对优势菌属，其对应的相对丰度排序为T3组>T1组>T2组>CK组，但组间差异不显著;未知属f型拟杆菌目RF16菌、普雷沃氏菌科UCG-001和解琥珀酸菌属均表现为T3组显著高于其他处理组。拟杆菌门和厚壁菌门为反刍动物瘤胃菌门水平优势菌群（Indugu et al.，2017;甄玉国等，2018;赵梦迪等，2019），对瘤胃的消化吸收功能有重要影响。拟杆菌门中的普雷沃氏菌属是瘤胃中非纤维性碳水化合物的主要降解者;厚壁菌门中的瘤胃球菌属、丁酸弧菌属和假丁酸弧菌属等是瘤胃中分解植物纤维的主要菌属。可见，以枯草芽孢杆菌（1.35×107 CUF/mL）+乳酸片球菌（1.16×107 CUF/mL）联合处理的青贮甘蔗尾叶能有效提高努比亚山羊瘤胃降解粗纤维的能力及机体对非纤维性碳水化合物的消化能力。

Dolci等（2011）研究报道，发酵初期的优良发酵菌种数量及其所占比例在很大程度上决定了青贮饲料的发酵品质。在本研究中，努比亚山羊瘤胃液纤维杆菌门和普雷沃氏菌科UCG-003的相对丰度均以T2组最高，且显著高于其他处理组，理研菌科RC9肠道菌的相对丰度则以T1组显著高于其他处理组，究其原因可能是发酵菌剂改变了青贮甘蔗尾叶的微生物多样性及菌群结构，进而影响努比亚山羊瘤胃微生物区系，但具体作用机理有待进一步探究。Alpha多样性主要用于反映物种丰富度、均匀度及测序深度（Caporaso et al.，2012）。本研究基于Illumina高通量测序分析，CK、T1、T2和T3组最终获得的OUT数量排序为T3组（1637个）>T2组（1603个）>CK组（1576个）>T1组（1560个）;各处理组间的Chao1指数排序为T3组>T2组>T1组>CK组，但差异不显著;Shannon指数排序为T3组>T2组>T1组>CK组，其中T3组显著高于CK组和T1组;Simpson指数排序为T1组>CK组>T2组>T3组，各组间差异也不显著。综上所述，T3组努比亚山羊瘤胃微生物种群数量多、多样性水平高，更有利于提高努比亚山羊瘤胃降解粗纤维的能力及机体对非纤维性碳水化合物的消化能力。

4 结论

经枯草芽孢杆菌+乳酸片球菌处理的甘蔗尾叶青贮效果最佳，以其饲喂努比亚山羊可增加瘤胃微生物种群数量及多样性水平，进而提高努比亚山羊瘤胃降解粗纤维的能力及机体对非纤维性碳水化合物的消化能力。

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（責任编辑 兰宗宝）