牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配促进睾丸间质细胞生成雄性激素

方磊，王雨辰，马永庆，张海欣，陆路，王憬，谷瑞增，魏颖

（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015）

勃起功能障碍（ED）是一个阴茎能否勃起以及能否保持阴茎硬度以达到满意性交的问题，越来越多的男性患有ED，且患病率逐年升高[1]。阴茎勃起是一个复杂的心理生理过程，本质是一系列神经-血管活动，受到性刺激后，非胆碱能、非肾上腺素能神经末梢会释放神经递质，刺激神经型一氧化氮合酶（nNOS）和海绵体血管内皮细胞上的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化产生NO，并经过NO/cGMP信号通路的传导，使阴茎海绵体平滑肌松弛，血管扩张充血，促进并维持阴茎勃起[2,3]。睾酮是机体内主要的循环雄激素，对男性的性别分化和发育、第二性征、生殖道功能和性功能均有重要作用。精子是在睾丸细胞内产生的，生精过程中睾丸内的生精细胞所处的氧化环境与精子的发育和分化密切相关[4]。目前，临床上有多种治疗ED的方法，如5型磷酸二酯酶抑制剂、手术治疗、真空负压吸引和阴茎假体植入术等多种治疗手段，但这些治疗手段因有较严重的不良反应并不为多数患者所接受[5-7]。因此，开发针对ED的口服新药物是当前临床治疗的迫切需求，也具有广阔的市场前景。

男性的雄激素主要由睾丸间质细胞分泌，而睾酮作为最主要的雄激素，可以通过剂量依赖的方式促进精子的产生，并改善肌肉质量和增强体力，在维持男性健康方面发挥着重要作用。生物活性肽是由蛋白质经酶解消化制备，一般含有3~20个氨基酸残基，具有不同的生物活性，其活性取决于它们的氨基酸组成及其排列顺序；低聚肽是位于氨基酸和蛋白质之间的片段，由于其分子量较小可不经消化直接被胃吸收，且比游离氨基酸消化更快更多，具有更高的生物效价和营养价值。张亭等研究发现牡蛎低聚肽配伍核桃低聚肽和山药多糖通过增加雄性小鼠附性器官指数，提高NO、睾酮和cGMP含量并降低PDE5水平增强雄性小鼠的性功能[8]；刘瑜等通过实验进一步证明补充牡蛎低聚肽能够通过改善下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）有效防止环磷酰胺（CTX）引起的中老年男性雄激素部分缺乏综合征（PADAM）的形成，显著改善性功能和生殖功能[9]；精氨酸可以合成信号分子NO以及参与某些多胺类物质的合成，而NO和多胺对于男性勃起功能和精子生成至关重要，补充精氨酸或富含精氨酸的蛋白质可以提高男性的性功能；紫苏籽肽可以有效改善环磷酰胺造成的大鼠生殖损伤状况从而达到改善性功能的作用以及提高大鼠血清中IL-2、IFN-γ、IgG水平和免疫器官脏器指数可能与紫苏籽肽富含精氨酸有关[10]；此外，据报道鹿角多肽、大豆多肽等具有提高血清睾酮含量和改善运动性低血睾酮的作用[11]。牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽是经现代酶解技术制备的小分子低聚肽，本文以牡蛎肽为主，然后复配大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽，研究其对睾丸间质细胞雄激素生成的研究，开发具有改善男性性功能的食源低聚肽组合，为低聚肽改善男性性功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽，实验室自制；小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞），上海冠导生物工程有限公司；DMEM/F12（1:1）培养基、胎牛血清，美国Gibco公司；胰蛋白酶、缓冲液PBS、青霉素链霉素溶液，碧云天生物技术研究所；NO测定试剂盒、SOD测定试剂盒、睾酮测定试剂盒、二氢睾酮测定试剂盒、cGMP测定试剂盒，北京百智生物科技公司；西地那非，美国Sigma公司；DMSO，西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

BX53型倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；细胞培养箱，美国Thermo公司；SpectraMax® iD5型多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；Accuri C6型流式细胞仪，美国BD生物科学仪器及软件公司；ESCO AC2-6S1生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司；3K-15型冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 食源性肽的制备

牡蛎肉→水洗→匀浆→加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解4 h→灭酶→离心取上清→陶瓷膜过滤→浓缩→活性炭脱色→过滤→灭菌→喷雾干燥→牡蛎肽

大豆分离蛋白→加水混匀→调节pH至8.5加入碱性蛋白酶酶解2 h→调pH至7.0加入中性蛋白酶酶解2 h→灭酶→离心取上清液→超滤膜超滤→浓缩→灭菌→喷雾干燥→大豆肽

鳕鱼鱼皮→洗净→润涨→绞碎匀浆→调节温度至55 ℃，pH至8.5，加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解3 h→灭酶→离心取上清液→陶瓷膜过滤→浓缩→灭菌→喷雾干燥→胶原肽

将紫苏籽蛋白粉→匀浆→调pH至5.5~6.0→加热至45~55℃→加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解4 h→灭酶→离心取上清液→陶瓷膜过滤→减压浓缩→硅藻土过滤→灭菌→喷雾干→紫苏籽肽

1.3.2 氨基酸组成分析

依据GB/T 5009.124方法，采用L-8900日立全自动氨基酸分析仪对牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽的氨基酸组成进行测定。

1.3.3 分子量分布测定

将样品用流动相溶解后并经孔径0.2 μm聚四氟乙烯过滤膜过滤，然后通过高效液相色谱仪进行凝胶过滤，根据标准曲线得到样品的分子量分布。

1.3.4 TM3细胞培养

使用含有5% HS、2.5% FBS的DMEM/F12（1:1）培养基，在37 ℃，5% CO2及充分饱和湿度的培养箱中培养。根据细胞的实际情况，2~3 d换一次液，待细胞融合至培养皿的80%左右时，弃掉培养瓶中旧培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞2~3次，加入适量室温复温的0.05%胰酶消化液，按照1:3传代培养。3次传代后取处于对数期、生长状态良好的细胞用于实验。

1.3.5 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞存活的影响

1.2.2 肠外营养 采取全肠外营养支持，静脉营养配伍方案与肠内营养组相同，总热量约为110kj/（kg·d），给予静脉支持。

将处于对数生长期的细胞消化后，用DMEM/F12完全培养基（含10% FBS和1%青霉素链霉素溶液）调整细胞密度为105个/mL，接于96孔板，每孔100 μL细胞悬液。于CO2培养箱中培养24 h，细胞单层贴壁后更换DMEM/F12不完全培养基，加入相应浓度复配的样品溶液（牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽浓度均为400 μg/mL，分别以体积1:1、2:1、4:1、8:1复配，组别简称为牡大（1:1）、牡大（2:1）、牡大（4:1）、牡大（8:1）、牡胶（1:1）、牡胶（2:1）、牡胶（4:1）、牡胶（8:1）、牡紫（1:1）、牡紫（2:1）、牡紫（4:1）、牡紫（8:1）继续培养24 h，然后用MTT法检测细胞存活率，计算公式为：

1.3.6 检测指标与方法

分别检测细胞培养上清中NO（硝酸还原酶法）、睾酮（竞争ELISA法）、二氢睾酮（竞争ELISA法）、及胞内SOD（WST-8法）、MDA（硫代巴比妥酸法）、cGMP（竞争ELISA法）产生量，并用各孔的蛋白总量（BCA法）进行校正，评价牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽的复配调节TM3细胞雄激素生成作用。

1.3.7 统计学处理

实验数据采用Origin 9.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析，若t检验，p<0.05，则证明数据差异具有显著性。

2 结果

2.1 牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽的氨基酸组成和分子量分布

牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽的氨基酸总量分别为57.74%、83.81%、85.91%、79.42%，四种低聚肽都含有较高的精氨酸，尤其紫苏籽肽中的精氨酸含量最高为10.02%，精氨酸对于男性精子的生成具有非常重要的作用，精氨酸通过精氨酸酶途径和NO合成途径参与免疫调控以及精子生成[12,13]；有研究报道，肽的抗氧化活性与其氨基酸组成有关。许多氨基酸具有抗氧化活性[14,15]，如赖氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等；由表1可知，牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽均含有较高的亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，可改善细胞内的氧化环境，睾丸间质细胞的氧化环境对睾酮、二氢睾酮等雄性激素的生成至关重要；脯氨酸通过其代谢产物5-吡咯啉羧酸调控细胞增殖和DNA合成以及影响促进精子生成的多胺类物质的合成；牡蛎肽、大豆肽、胶原肽和紫苏籽肽分子量分布如表2所示，4种肽的分子量<1000 u以下占比均分别为88.54%、92.53%、88.53%和91.38%，有研究显示分子量小于1000 u的蛋白水解物更易被人体吸收从而发挥功能活性[16,17]。

表1 牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of oyster peptide, soybean peptide, collagen peptide and perill peptide

表2 牡蛎肽、大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽的分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of oyster peptide, soybean peptide, collagen peptide, and perilla peptide

2.2 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞存活率的影响

图1 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对细胞存活的影响Fig.1 Effect of oyster peptide, soybean peptide, collagen peptide,and perillin on cell survival

2.3 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞睾酮和NO的影响

TM3细胞在促黄体生成激素的调节下合成和分泌睾酮，睾酮合成后，一方面可以释放到淋巴液，并转运到曲细精管及附睾，促进精子发生、成熟；另一方面，睾酮进人血流，周流全身而发挥作用[18]。此外，血清中的睾酮可以调节基因，抑制PDE5酶合成，促进NOs酶、精氨酸酶的产生；NO是一种非肾上腺非胆碱的神经递质，是引起阴茎平滑肌松弛和血液进入海绵体使之充盈勃起的关键物质[19,20]；NO是由一氧化氮合酶（NOS）催化产生的，而NOS的底物为左旋精氨酸（L-Arg）；在阴茎组织中，它成为海绵体舒张的重要信使，阴茎勃起的诱导和维持的过程起着决定性作用[21]。

由图2可知，阳性对照西地那非和牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配均能提高TM3细胞睾酮的分泌量、增加TM3细胞培养上清的NO浓度，但其提高TM3细胞分泌睾酮和NO作用要低于西地那非；与空白对照组相比，牡蛎肽与紫苏籽肽（2:1）复配对睾酮和NO促进作用最好，分别提高了50.64%、125.61%；不同复配组升高睾酮和NO水平效果大小排序为：牡蛎肽+紫苏籽肽>牡蛎肽+胶原肽>牡蛎肽+大豆肽。有研究报道，雄性小鼠服用玛咖后血清NO浓度提高，阴茎勃起能力加强，勃起时间延长，说明NO能刺激阴茎勃起[19]，对改善性功能有重要作用；曹东等研究表明丽江玛咖正丁醇/水提取物具有提高雄性小鼠性行为的作用，对雄性小鼠睾酮和雌二醇含量无明显影响，说明牡蛎肽与紫苏籽肽复配对睾酮雄性激素的调节要优于丽江玛咖提取物[22]。

图2 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞睾酮(a)和NO(b)的影响Fig.2 Effect of oyster peptides, soybean peptides, collagen peptides, and perillin pairs on testosterone (a) and NO (b) in TM3 cells

2.4 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞二氢睾酮的影响

二氢睾酮是由睾丸间质细胞分泌的一种类固醇激素，是人体内主要的雄激素，与男性第二性征的发育有关。睾酮作为一种激素原，在芳香化酶的作用下可转变为17β-雌二醇，广泛分布于全身血液中，能够与生精细胞的雄激素受体结合，促进精子的生成；主要作用是维持生精、正常的性欲以及刺激生殖器官的发育，是男性重要的雄性激素。男性未成年时期二氢睾酮分泌不足，就会导致男性第二性征发育不明显，产生小阴茎，小阴囊等病理现象。

由图3可知，阳性对照西地那非和牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配均能提高TM3细胞二氢睾酮的分泌量，但复配组的促进作用要低于西地那非；复配组升高二氢睾酮水平效果大小排序为：牡蛎肽+紫苏籽肽>牡蛎肽+胶原肽>牡蛎肽+大豆肽，该结果与促进TM3细胞分泌睾酮趋势相一致；表明牡蛎肽和紫苏籽肽复配可显著提高血清中睾酮和二氢睾酮雄激素水平，这可能与酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸以及支链氨基酸的促睾酮、二氢睾酮分泌活性有关[10]。

图3 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞二氢睾酮的影响Fig.3 Effect of oyster peptides, soybean peptides, collagen peptides, and perillin pairs on dihydrotestosterone in TM3 cells

2.5 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞抗氧化活性的影响

精子是在睾丸细胞内产生的，生精过程中睾丸内的生精细胞所处的氧化环境与精子的发育和分化密切相关[3]。睾丸细胞内良好的氧化环境有利于精子及雄性激素的生成。SOD酶活力和MDA含量是评价机体抗氧化性常用的两个指标，SOD是机体内重要的抗氧化物酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，如O2-∙、H2O2、∙OH，减少细胞膜受到的损伤。睾丸细胞内的SOD酶能够维持细胞正常的氧化环境并调控生精细胞的精子生成。

由表3可知，阳性对照西地那非和牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配均能提高TM3细胞的SOD酶活力，相比于对照组，西地那非组和牡蛎肽与大豆肽（2:1）、胶原肽（1:1）、紫苏籽肽（2:1）复配分别提升了165.87%、34.56%、17.83%、87.17%，增强TM3细胞SOD酶活效果的顺序为：牡蛎肽+紫苏籽肽>牡蛎肽+大豆肽>牡蛎肽+胶原肽；此外，与对照组相比，阳性对照西地那非和牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配均能显著降低TM3细胞内的MDA浓度，其中牡蛎肽与紫苏籽肽（2:1）降低效果最好，相比对照组降低了61.60%，与西地那非的降低效果61.99%相近，说明牡蛎肽与紫苏籽肽复配更有利于稳定TM3细胞内的氧化环境；综上牡蛎肽和紫苏籽肽复配能显著提高TM3细胞的SOD活力，增强细胞内的抗氧化能力，可能与精氨酸对SOD活性的激活作用有关；牡蛎肽和紫苏籽肽复配能减轻脂质过氧化程度，与牡蛎肽和紫苏籽肽含有的半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸等参与自由基消除反应和谷氨酸、精氨酸等通过侧链的螯合作用抑制自由基氧化反应可能有关；机体内稳定的氧化环境可减轻细胞损伤及线粒体功能障碍，减少损伤精子膜和DNA，有利于维持精子的稳定。

表3 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞中SOD酶活、MDA含量的影响Table 3 Effects of oyster peptides, soybean peptides, collagen peptides, and perilla peptides on SOD enzyme activity and MDA content in TM3 cells

2.6 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞cGMP的影响

阴茎勃起是指由于受到性刺激阴茎海绵体快速充血，阴茎迅速充血变硬并延伸的现象。副交感神经中枢通过释放可溶性神经递质NO来激活可溶性腺苷酸环化酶，细胞内的GTP转化成cGMP，cGMP作为细胞内的第二信使，可以使细胞内的Ca2+浓度降低，导致细胞内Ca2+减少，海绵体平滑肌舒张，海绵体内压增加，同时，白膜下小静脉被动受压闭塞，产生勃起[21]。

由图4可知，阳性对照西地那非和牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配均能促进TM3细胞内的cGMP含量，但阳性对照西地那非作用最强；增强TM3细胞cGMP含量的顺序为：牡蛎肽+紫苏籽肽>牡蛎肽+大豆肽>牡蛎肽+胶原肽；此外，牡蛎肽与紫苏籽肽（2:1）复配提高TM3细胞分泌cGMP效果最好，与对照组相比，提高了近88.44%，但促进效果仍低于阳性对照西地那非。

图4 牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配对TM3细胞cGMP的影响Fig.4 Effect of oyster peptide, soybean peptide, collagen peptide,and perillin on cGMP of TM3 cells

3 结论

本文对牡蛎肽、大豆肽、胶原肽和紫苏籽肽的氨基酸组成进行了分析，结果表明四种低聚肽都富含精氨酸、尤其紫苏籽肽的精氨酸含量最高为10.02%；然后将牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽（浓度均为400 μg/mL，分别以体积1:1、2:1、4:1、8:1）复配作用于小鼠睾丸间质细胞（TM3），并以西地那非作为阳性对照，结果发现西地那非和牡蛎肽与大豆肽、胶原肽、紫苏籽肽复配均能刺激TM3细胞分泌睾酮和二氢睾酮等雄性激素、提高了TM3细胞内的NO和cGMP含量，增强了TM3细胞内的SOD酶活，显著降低细胞内的MDA浓度，维持了细胞内正常的氧化环境，有利于雄性激素和精子的生成；牡蛎肽和紫苏籽肽复配的促进效果最好，可能与牡蛎肽、紫苏籽肽富含精氨酸有关，具有改善男性性功能的作用，为牡蛎肽和紫苏籽肽应用于保健功能食品奠定了理论基础。