云南省某规模化奶牛场乳房炎细菌的分离鉴定与耐药性分析

王慧辉，王生奎，杨仕标，宋建领，赵文华，李富祥*

(1.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201； 2. 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

奶牛乳房炎在世界各地奶牛场中常发，是危害乳品行业最主要的疾病。该病可导致奶牛产奶量减少，乳成分变化和乳制品质量下降，严重的可导致奶牛死亡，严重危害奶牛健康和乳制品质量安全，给奶牛养殖场(户)造成严重的经济损失。临床上将奶牛乳房炎分为3种类型，即临床型乳房炎、亚临床型乳房炎和慢性乳房炎。研究表明，奶牛乳房炎的致病菌有150多种，其中以大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、支原体和金黄色葡萄球菌等最为常见[1]。目前，奶牛乳房炎的治疗仍然以抗生素治疗为首选方法，但随着乳房炎细菌耐药性的不断增强，乳房炎的治疗变得更加困难。因此，细菌分离鉴定和筛选敏感抗菌药物，对奶牛乳房炎进行针对性治疗具有重要的实际应用意义。本研究对云南某规模化奶牛场临床乳房炎病例进行细菌分离鉴定，明确奶牛乳房炎细菌种类，并对分离株进行药物敏感性试验分析，为云南省奶牛乳房炎的预防和控制提供理论依据。

1 材料

1.1 样品采集

2020年7月，在云南省某奶牛场随机选择临床乳房炎奶牛24头，用碘伏和75%酒精对乳区消毒，去掉前两把奶，无菌收集4个乳区的混合乳样，密封并做好标记，放置于冷藏箱中送至云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室进行细菌学诊断。

1.2 主要试剂

营养琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，2×EasyTaq PCR SuperMix和Trans 2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，22种细菌微量生化管和氧化酶试纸购自杭州滨和微生物试剂有限公司，18种药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，氟苯尼考药敏纸片购自英国OXOID公司。

2 方法

2.1 细菌分离

分别将24份乳样划线接种于营养琼脂培养基上，37 ℃静置培养过夜。观察菌落形态，挑取典型单菌落进行纯培养，将纯培养得到的分离株进行编号。同时进行革兰氏染色、镜检观察菌体形态和染色特性。

2.2 细菌生化鉴定

用灭菌生理盐水将营养琼脂平板上的菌落洗脱下来制成菌悬液，接种22种细菌微量生化管，37℃培养过夜，按细菌微量生化管操作说明对各细菌分离株进行生化鉴定；按氧化酶试纸操作说明进行氧化酶试验；过氧化氢酶试验方法：用接种环将菌落挑至玻璃板上，滴加3%双氧水，有气泡产生者为过氧化氢酶试验阳性。

2.3 细菌16S rDNA基因鉴定

按细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明分别提取各细菌分离株基因组DNA作为PCR模板，按参考文献[2]介绍的方法对6株细菌的16S rDNA基因进行PCR扩增和测序。将测序结果用SeqMan软件进行拼接，将拼接的16S rDNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对鉴定。

2.4 药物敏感性试验

参照美国临床标准委员会(NCCLS) 推荐的K-B 琼脂方法进行药物敏感性试验，每个营养琼脂平板均匀贴5片药敏纸片，将平板反转，37 ℃培养18～24 h，从平板背面测量抑菌圈直径(mm)。药敏试验结果判断标准：直径<10mm 为耐药；10～15mm为中度敏感；≥15mm为高度敏感。

3 结果

3.1 细菌分离结果

用营养琼脂培养基对细菌进行分离，分离到6株细菌(M1—M6)，其中M1分离株菌落中等大小，呈淡黄色，表面光滑、圆形凸起、边缘整齐；镜检为革兰氏阴性小球杆菌，成对排列。M2分离株为灰白色小菌落，菌落表面光滑、圆形凸起、边缘整齐；镜检为革兰氏阴性小球杆菌。M3分离株为灰白色小菌落，菌落表面光滑、圆形凸起，边缘整齐、湿润不透明；镜检为革兰氏阳性球菌，堆聚成葡萄串状。M4和M5分离株为灰白色细小菌落，菌落圆形、表面光滑、圆形凸起、边缘整齐；镜检为革兰氏阳性小球菌，短链排列。M6分离株为灰白色中等大小菌落，菌落扁平，菌落表面不光滑、边缘不圆整；镜检为革兰氏阳性大杆菌。

3.2 细菌生化鉴定结果

生化鉴定结果显示(见表1)，M1分离株氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、分解葡萄糖产酸，主要生化特征与变异不动杆菌模式菌株NIPH 2171相符[3]。M2氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、分解葡萄糖产酸、分解麦芽糖产酸，主要生化特征与伪鲁氏不动杆菌模式菌株CCUG 67963相符[4]。M3分离株鸟氨酸脱羧酶阴性，分解葡萄糖、果糖、蔗糖产酸，不分解棉子糖和纤维二糖产酸等，主要生化特征与拉萨牦牛乳中分离的沃氏葡萄球菌相同[5]。M4和M5分离株分解乳糖产酸，不分解菊糖、木糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇产酸，主要生化特征与云南蒙自两株奶牛停乳链球菌相同[6]。M6分离株过氧化氢酶阳性、分解葡萄糖产酸，鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阴性、吲哚试验阴性，不分解甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、木糖和乳糖产酸，主要生化特征与副蕈状芽孢杆菌相符[7]。

表1 分离株生化鉴定结果

3.3 细菌16S rDNA基因鉴定结果

16S rDNA基因序列BLAST比对结果显示，M1—M6分离株分别与变异不动杆菌(Acinetobactervariabilis)、伪鲁氏不动杆菌(Acinetobacterpseudolwoffii)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、停乳链球菌(Streptococcudysagalactiae)、停乳链球菌和副蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)的16S rDNA基因序列最高同源性分别为99.7%、99.6%、99.6%、100%、99.6%和99.7%。

根据菌落形态特征、革兰氏染色菌体形态、生化试验结果和16S rDNA基因鉴定结果，将M1—M6分离株分别鉴定为变异不动杆菌、伪鲁氏不动杆菌、沃氏葡萄球菌、停乳链球菌、停乳链球菌和副蕈状芽孢杆菌。

3.4 药物敏感性试验结果

表2 分离菌株药敏试验结果

4 讨论

本研究从云南某规模化奶牛场临床乳房炎乳样中分离到变异不动杆菌(Acinetobactervariabilis)、伪鲁氏不动杆菌(Acinetobacterpseudolwoffii)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、停乳链球菌(Streptococcudysagalactiae)和副蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)。其中变异不动杆菌、伪鲁氏不动杆菌和副蕈状芽孢杆菌的分离鉴定，表明云南奶牛乳房炎细菌存在丰富的多样性，在奶牛乳房炎防控中应引起重视。

生化鉴定试验中，沃氏葡萄球菌(M3)分离株尿素酶阴性、分解乳糖产酸、不分解麦芽糖产酸等生化特征与拉萨牦牛乳中分离的沃氏葡萄球菌不同[5]，表明其为不同的分离株。停乳链球菌(M4和M5)分离株分解麦芽糖产酸的生化特征与云南蒙自两株奶牛停乳链球菌不同[6]。M4不分解果糖产酸而M5分解果糖产酸，表明M4和M5也为不同分离株。

奶牛乳房炎的致病菌多种多样，常见的有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、停乳链球菌等，不常见的有化脓隐秘杆菌[8]、沃氏葡萄球菌[9]等。本研究从奶牛乳房炎乳样中分离到变异不动杆菌、伪鲁氏不动杆菌和副蕈状芽孢杆菌，这3种细菌在奶牛乳房炎中的致病作用有待进一步深入研究。