青、红菱角皮中抗氧化物质的提取及其活性

黄爱妮，王洪斌，梅大佐，王清章，严碧云，李丽琴

1.武昌工学院食品与健康研究所（武汉 430065）；2.湖北华贵食品有限公司（洪湖 433200）

菱角为一年生水生草本植物，在中国栽培历史有3 000年。菱角皮富含多酚、黄酮、多糖、皂苷、萜类和甾体类以及生物碱类等生理活性成分，不仅有降低α-葡萄糖苷酶、保护肝活性和降糖等功能，还具有良好的抗氧化效果[1-3]。

在菱角加工过程中，菱角皮常作为下脚料被丢弃或作饲料、燃料，菱角皮资源并未得到有效的开发利用。通过超声波辅助乙醇浸提法从青、红菱角皮中提取活性组分，通过DPPH、ABTS+、FRAP法测定其活性组分的清除力及还原力，对菱角皮中抗氧化物质的活性进行研究，为菱角皮的利用提供理论基础，可以在一定程度上减少菱角皮资源浪费，提高利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青、红菱角皮，采于湖北洪湖，经60 ℃烘干，用微型植物粉碎机粉碎过0.42 mm直径筛后装袋备用。

KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；UV-1800紫外-可见分光光度计（日本岛津有限公司）；AR2140电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式真空泵（郑州恒岩仪器有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 菱角皮中抗氧化物质的提取与分离

分别称取一定量的青、红菱角皮粉末，用95%的乙醇溶液进行超声波辅助提取。提取条件：料液比1∶20（g/mL）、提取温度50 ℃、超声功率500 W、提取时间0.5 h。将提取液进行抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪将乙醇减压回收，用石油醚多次萃取提取物，取上层液体依次用乙酸乙酯、正丁醇按上述操作进行萃取，在30，35和50 ℃条件下将各萃取液减压回收，分别得到青、红菱角皮石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相极性物质。

1.2.2 菱角皮中抗氧化物质含量的测定方法

1.2.2.1 黄酮含量的测定方法

黄酮标准曲线的制作：采用NaNO2-AlCl3-NaOH法[4-7]。准确称取5 mg芦丁标准品，用60%乙醇配制成500 μg/mL的标准溶液。吸取适量的芦丁标准液依次稀释至0，10，100，200，300，400和500 μg/mL，分别吸取0.25 mL的各浓度芦丁标准溶液于试管中，加入1.25 mL蒸馏水后，精密加入5%亚硝酸盐溶液75 μL，振荡摇匀，静置反应6 min后，加入10%硝酸铝溶液150 μL，充分摇匀，静置反应6 min后，加入0.5 mL的1 mol/L的氢氧化钠水溶液，用蒸馏水定容至2.5 mL，充分摇匀后静置反应15 min，以蒸馏水做空白对照，用蒸馏水调零，在510 nm处测定吸光度，建立黄酮标准曲线。

样品中黄酮质量分数的测定：吸取0.25 mL 500 μg/mL的各组分样品液，按上述方法测定，代入芦丁标准曲线方程计算黄酮质量分数。

1.2.2.2 多酚质量分数的测定方法

多酚标准曲线的制定：准确称取5 mg没食子酸标准品，用80%甲醇配制成500 μg/mL标准溶液。吸取适量没食子酸标准液依次稀释至0，10，100，200，300，400和500 μg/mL，分别取50 μL的各浓度没食子酸溶液于试管中，加入450 μL的蒸馏水，吸取2.5 mL的稀释10倍福林酚试剂，振荡摇匀，静置反应5 min后，加入2 mL饱和碳酸钠溶液（75 g/L），充分摇匀，在30 ℃水浴避光反应1.5 h，以蒸馏水做空白对照，用蒸馏水调零，在可见分光光度计765 nm处测定吸光度，建立多酚标准曲线[8-9]。

样品中多酚质量分数的测定：吸取50 μL 500 μg/mL的各组分样品液，按上述方法测定，代入没食子酸标准曲线方程计算多酚质量分数。

1.2.3 抗氧化活性的测定方法

1.2.3.1 DPPH清除活性的测定方法[10-11]

准确称取1 mg样品，用二甲亚砜（DMSO）配制成1 000 μg/mL的样品溶液。吸取适量样品溶液稀释至31.25，62.5，125，250，500和1 000 μg/mL，分别取0.1 mL各浓度样品溶液，加入3 mL 0.004%的DPPH溶液，充分摇匀，室温下避光30 min，在517 nm处测定吸光度。空白对照采用无水甲醇，阳性对照采用VC溶液，用蒸馏水调零。做3组平行试验。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的测定方法

分别将0.038 4 g ABTS+与0.0134 g过硫酸钾溶解于10 mL蒸馏水当中，将两者1∶1混合，于暗处反应16 h后得到ABTS+自由基母液。用80%乙醇溶液将母液稀释至734 nm处吸光度0.700～0.750，最终得到ABTS+自由基工作液。准确称取1 mg样品，用二甲亚砜（DMSO）配制成1 000 μg/mL样品溶液。吸取适量样品溶液，按照二倍稀释法稀释样品液至31.25，62.5，125，250，500和1 000 μg/mL；分别吸取0.1 mL各浓度样品液，加入3.9 mL ABTS+自由基工作液，振荡摇匀，静置反应6 min，在734 nm处测定吸光度[12-13]。空白对照采用80%乙醇水溶液，阳性对照采用VC溶液，用蒸馏水调零。做3组平行试验。

1.2.3.3 FRAP活性测定

将pH 3.6，0.03 mol/L的醋酸钠-醋酸缓冲液、0.01 mol/L的2, 4, 6-三吡啶基三嗪（TPTZ）和0.02 mol/L的FeCl3溶液按体积比10∶1∶1混匀，得到新鲜FRAP试剂。准确称取1 mg样品，用二甲亚砜（DMSO）配制成1 000 μg/mL样品溶液。吸取适量样品溶液，按照2倍稀释法稀释样品液至31.25，62.5，125，250，500和1 000 μg/mL，分别吸取0.1 mL各浓度样品溶液，加入3.0 mL现配的新鲜FRAP试剂，混合均匀，于25 ℃水浴5 min，在593 nm处测定吸光度。以去离子水做空白样，阳性对照采用VC溶液。做3组平行试验。

1.2.4 大孔树脂柱层析分离纯化

取380 mL HP20树脂湿法装柱，分别取8 g青菱角皮和9.8 g红菱角皮乙酸乙酯相粉末溶于少量水蒸馏中（即样液），将样液加到树脂柱的上端，静置吸附0.5 h。依次用蒸馏水，20%，30%，40%，50%和60%乙醇溶液分别作为洗脱剂，进行洗脱，洗脱体积800 mL，以6 mL/min流速进行洗脱并收集洗脱液。将同体积分数乙醇洗脱液合并成为1个样品，洗脱剂浓度从低到高进行洗脱并获得不同浓度洗脱物质。

2 结果与分析

2.1 青、红菱角皮各萃取相的得率

青菱角皮醇提物的质量为71.8 g，占菱角皮干重的14.13%，经不同萃取剂萃取，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物含量分别占菱角皮干重的1.26%，8.21%，1.34%和1.59%，其中乙酸乙酯相萃取物的质量最高。红菱角皮粉末醇提物的质量为21 g，占红菱角皮干重的21%，经不同萃取剂萃取，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物分别占菱角皮干重的1%，11.1%，6.6%和2.3%，其中乙酸乙酯相萃取物的质量最高。

2.2 乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物得率

青菱角皮乙酸乙酯相萃取物质量为8 g，分别采用20%，30%，40%，50%和60%乙醇溶液进行洗脱后，洗脱物得率分别为4.52%，30.69%，31.45%，21.75%和3.29%，其中40%乙醇洗脱物得率最高。红菱角皮乙酸乙酯相萃取物质量为9.8 g，分别采用20%，30%，40%，50%和60%乙醇溶液进行洗脱后，洗脱物得率分别为21.28%，44.29%，21.67%，1.50%和0.83%，其中30%乙醇洗脱物得率最高。

图2 乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物得率

2.3 黄酮质量分数的测定结果

2.3.1 芦丁标准曲线

测定的芦丁标准曲线见图3。结果表明，芦丁标准曲线的回归方程为y=0.001x+0.005 6，R2=0.999 2。式中x表示芦丁标准液质量浓度（μg/mL），y表示在510 nm处测得的吸光度。该标准曲线线性良好，可用于黄酮质量分数的测定。

图3 芦丁标准曲线

2.3.2 青、红菱角皮各萃取相中黄酮质量分数的测定结果

青、红菱角皮各萃取相中黄酮的质量分数见图4。结果表明，青、红菱角皮石油醚相萃取物中黄酮质量分数最高，均为15.38%，青菱角皮乙酸乙酯相萃取物中黄酮的质量分数略高于红菱角皮，为11.88%，红菱角皮水相萃取物中黄酮质量分数最低，为2.38%。青菱角皮各萃取相中黄酮质量分数均高于红菱角皮。

图4 青、红菱角皮各萃取相黄酮质量分数

2.3.3 乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物黄酮质量分数测定

乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物中黄酮的质量分数见图5。结果表明，青、红菱角皮各浓度洗脱物中，黄酮质量分数普遍较低，大多在25%以下。红菱角皮60%乙醇洗脱物中黄酮质量分数最高，黄酮质量分数为25.96%，其次红菱角皮50%乙醇洗脱物黄酮质量分数为23.38%，红菱角皮中30%乙醇洗脱物黄酮质量分数最低，黄酮质量分数为13.14%。总体而言，红菱角皮各浓度洗脱物中黄酮质量分数基本都高于青菱角皮。

图5 乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物黄酮质量分数

2.4 多酚质量分数测定结果

2.4.1 没食子酸标准曲线

测定的没食子酸标准曲线见图6。没食子酸标准曲线回归方程为y=0.001x+0.001 8，R2=0.999 8。式中x表示没食子酸标准液的质量浓度（μg/mL），y表示在765 nm处测得的吸光度。该标准曲线的线性良好，可用于多酚质量分数的测定。

图6 没食子酸标准曲线

2.4.2 青、红菱角皮各萃取相中多酚质量分数的测定结果

青、红菱角皮各萃取相中多酚的质量分数见图7。结果表明，青菱角皮乙酸乙酯萃取物中多酚质量分数最高，为45.54%，其次为红菱角皮乙酸乙酯萃取物，其多酚质量分数为44.84%，红菱角皮水相萃取物中多酚质量分数最低，为9.34%。青菱角皮各萃取相中多酚质量分数均高于红菱角皮。

图7 青、红菱角皮各萃取相多酚质量分数

2.4.3 乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物中多酚质量分数的测定结果

乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物中多酚的质量分数见图8。结果表明，青、红菱角皮各浓度洗脱物中，多酚的质量分数普遍较高，质量分数约90%。青菱角皮50%乙醇洗脱物中多酚质量分数最高，为89.71%。其次为青菱角皮40%乙醇洗脱物，多酚质量分数为85.88%。红菱角皮60%乙醇洗脱物中多酚质量分数最低，为49.31%。总体而言，青菱角皮各浓度洗脱物中多酚质量分数基本略高于红菱角皮。

图8 乙酸乙酯相大孔树脂柱层析各洗脱物多酚质量分数

2.5 青、红菱角皮各萃取相抗氧化活性的测定结果

2.5.1 青、红菱角皮各萃取相对DPPH自由基的清除活性

青、红菱角皮各萃取相对DPPH自由基的清除活性见图9。清除率IC50值越小，表明清除能力越强，即抗氧化性越强，反之亦然。由图9可知，青、红菱角皮各萃取相对DPPH自由基的清除能力为乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相，青菱角皮乙酸乙酯相萃取物清除率IC50值为22.827 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯相萃取物清除率IC50值为26.466 μg/mL；VC清除率IC50值为143.475 μg/mL。石油醚相、乙酸乙酯相萃取物的清除能力均为青菱角皮＞红菱角皮。正丁醇、水相萃取物的清除能力为红菱角皮＞青菱角皮。

图9 青、红菱角皮各萃取相对DPPH自由基的清除活性

2.5.2 青、红菱角皮各萃取相对ABTS+自由基的清除活性

青、红菱角皮各萃取相对ABTS+自由基的清除活性见图10。清除率IC50值越小，表明清除能力越强，即抗氧化性越强，反之亦然。由图10可知，青、红菱角皮各萃取相对ABTS+自由基的清除能力为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相＞水相；青菱角皮乙酸乙酯相萃取物清除率IC50值为145.055 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯相萃取物清除率IC50值为158.968 μg/mL；VC清除率IC50值为159.849 μg/mL。各萃取相清除能力均为青菱角皮＞红菱角皮，且红菱角皮水相萃取物对ABTS+自由基的清除能力不明显。

图1 青、红菱角皮各萃取相得率

图10 青、红菱角皮各萃取相对ABTS+自由基的清除能力

2.5.3 青、红菱角皮各萃取相的FRAP活性

青、红菱角皮各萃取相的FRAP活性测定结果见图11。还原力IC50值越小，表明还原能力越强，即抗氧化性越强，反之亦然。青、红菱角皮各萃取相的FRAP活性为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相＞水相；青菱角皮乙酸乙酯相还原力IC50值为25.169 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯相还原力IC50值为27.667 μg/mL，VC还原力IC50值为96.169 μg/mL。乙酸乙酯、石油醚相、正丁醇相、水相还原能力均为青菱角皮＞红菱角皮，且红菱角皮水相萃取物的FRAP活性不明显。

图11 青、红菱角皮各萃取相的FRAP活性

2.6 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物抗氧化活性的测定结果

2.6.1 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对DPPH自由基的清除活性

青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对DPPH自由基的清除活性见图12。清除率IC50值越小清除能力越强，反之亦然。由图12可知，青菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物清对DPPH除能力依次为40%＞50%＞60%＞30%＞20%；红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对DPPH清除能力依次为20%＞40%＞30%＞60%＞50%；40%，50%和60%浓度洗脱物清除能力：青菱角皮＞红菱角皮；20%和30%浓度洗脱物清除能力：红菱角皮＞青菱角皮。青菱角皮乙酸乙酯相40%浓度洗脱物清除能力优于其他浓度，清除率IC50值为50.036 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯相20%，30%和40%浓度洗脱物清除能力优于其他浓度，清除率IC50值分别为76.604，82.419和80.605 μg/mL；VC清除率IC50值为143.475 μg/mL。

图12 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对DPPH自由基的清除能力

2.6.2 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对ABTS+自由基的清除活性

青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对ABTS+自由基的清除活性见图13。清除率IC50值越小清除能力越强，反之亦然。青菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对ABTS+清除能力依次为40%＞20%＞30%＞50%＞60%。红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对ABTS+清除能力依次为30%＞40%＞20%＞50%＞60%；青菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对ABTS+清除能力皆高于红菱角皮。因此，青菱角皮乙酸乙酯相40%浓度洗脱物清除能力优于其他浓度，清除率IC50值为56.58 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯相20%，30%和40%浓度洗脱物清除能力优于其他浓度，清除率IC50值分别为79.693，72.248和78.714 μg/mL；VC清除率IC50值为159.849 μg/mL。

图13 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对ABTS+自由基的清除能力

2.6.3 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对FRAP的还原能力

青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对FRAP的还原能力测定结果见图14。还原力IC50值越小还原能力越强，反之亦然。青菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对FRAP的还原力依次为40%＞30%＞50%＞20%＞60%。红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对FRAP还原能力依次为20%＞30%＞40%＞50%＞60%；20%，30%和40%浓度洗脱物还原能力：红菱角皮＞青菱角皮。50%和60%浓度洗脱物还原能力：青菱角皮＞红菱角皮。青菱角皮乙酸乙酯相40%浓度洗脱物还原能力优于其他浓度，还原力IC50值为58.173 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯相20%，30%和40%浓度洗脱物还原能力都优于其他浓度，还原力IC50值分别为37.762，45.448和51.071 μg/mL；VC还原力IC50值为96.169 μg/mL。

图14 青、红菱角皮乙酸乙酯相各浓度洗脱物对FRAP的还原能力

3 结论

通过超声波辅助乙醇对青、红菱角皮中的抗氧化物质进行提取后，将得到的醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到不同萃取相的抗氧化活性物质，并采用DPPH、ABTS+自由基清除活性及FRAP活性对其活性组分进行抗氧化活性研究。结果表明，青、红菱角皮抗氧化组分主要分布于乙酸乙酯萃取相中；青菱角皮乙酸乙酯萃取相对DPPH、ABTS+自由基清除率及FRAP活性的IC50值分别为22.827，145.055和25.169 μg/mL；红菱角皮乙酸乙酯萃取相对DPPH、ABTS自由基清除率及FRAP活性的IC50值分别为26.466，157.986和27.667 μg/mL。采用大孔树脂HP20对青、红菱角皮的乙酸乙酯相萃取物进行分离，并测定各浓度洗脱物的抗氧化活性。结果表明，青菱角皮乙酸乙酯相萃取物在40%乙醇洗脱后抗氧化性最佳，红菱角皮乙酸乙酯相萃取物在20%，30%和40%乙醇洗脱后的抗氧化活性较佳，青菱角皮抗氧化活性优于红菱角皮。

试验结果为回收利用菱角皮资源、提高产品附加值提供指导和理论依据，为开发菱角皮中多酚、黄酮类成分提供数据支持。