基于CNKI数据库的禾草与非禾草内生真菌文献计量分析

李淑琴，陈振江，陈泰祥，李秀璋，慕彪彪，李春杰*

（1.兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业教育部工程研究中心，兰州大学甘肃省西部草业技术创新中心，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州730020；2.青海大学畜牧兽医科学院，青海省畜牧兽医科学院，青海西宁810016；3.兰州市生态林业试验总场，甘肃 兰州730085）

De Bary［1］于1866年最早提出内生菌（endophyte）的概念，用以区别植物表面的表生菌［1-2］，他将生活在植物组织内的微生物统称为内生菌。1898年Vogl从黑麦草（Lolium perenne）种子内分离出来第一株内生真菌［3］，国内外学术界对于内生真菌的研究已经有一百多年的历史，但直到八十年代初才开始被重视［4-5］。从目前的研究结果来看，内生真菌在植物体内普遍存在［2］，包括禾草［6-8］与非禾草［9-11］。

禾草内生真菌是指生长在禾本科草类植物体内并完成全部或大部分生活周期，但不导致禾草外部症状的一类真菌［12-13］，主要是指子囊菌纲（Ascomycetes），麦角菌科（Clavicipitaceae），瘤座菌族（Balansieae）的香柱菌属（Epichloë）［13-15］。主要通过种子进行垂直传播而侵染新的宿主禾草，与禾草形成互惠共生的关系。李翠英［16］于1989年首次对31份高羊茅（Festuca arundanacea）和21份多年生黑麦草进行了内生真菌的检测。后续我国学者对醉马草（Achnatherum inebrians）、野大麦（Hordeum brevisubulatum）、鹅观草（Roegneria kamoji）、雀麦草（Bromusjaponicus）和中华羊茅（Festuca elata）等禾草的Epichloë属内生真菌进行了一系列研究报道，主要集中在内生真菌多样性、次生代谢产物、抗逆生物学以及生态学等方面。到目前为止，我国学者至少已经发现了21个属，77种禾草中存在Epichloë属内生真菌［17］。Epichloë属内生真菌是一类特殊的微生物，一方面，在调节植株生长中发挥着重要作用，它可以促进禾草的生长，提高宿主禾草对多种非生物胁迫和生物胁迫的抗性［18-19］，例如，抗旱［20］、耐盐［19］、耐金属［21］、抗病［22］、抗虫［23］等。另一方面，由于内生真菌能够产生生物碱，主要有吲哚双萜类（indolditerpenes），麦角碱类（ergot）、黑麦草碱（peramine）以及波胺（lolines），其中前两种生物碱能够对家畜产生毒性，引起取食了内生真菌侵染的禾草的家畜中毒，给畜牧业造成重大损失，影响草地畜牧业的健康发展。而波胺和黑麦草碱能够对昆虫产生毒性，提高了宿主植物的抗虫性。

非禾草内生真菌对它们的宿主植物的生长发育同样发挥着重要作用，非禾草内生真菌共生体同样能够提高宿主植物抗逆性。在非禾草中，内生真菌是某些特殊植物的营养来源，是植株正常生长发育、生殖发育必不可少的条件［24］，其次利用内生真菌生产植物原药、功能化合物方面显示出巨大潜力，以及内生真菌代谢产物可能具有抗菌活性［25］、抗肿瘤活性［26］、抗HIV活性［27］、抗氧化活性［28］等特点。例如紫杉醇，最初从短叶红豆杉（Taxuschinensis）树皮中分离出来，能阻止癌细胞的扩散，是一种著名的抗肿瘤剂，并经相关研究发现，可以利用内生真菌来合成紫杉醇，又因该方法生长速率高，培养条件易掌握，易获得大量培养物而被广泛关注［26，29-30］。

我国幅员辽阔，生态系统丰富多彩，空间格局复杂多样，是世界上物种资源最丰富的国家。其中动物、植物、微生物以及环境所构成的生态系统中，微生物发挥着重要的调节作用，我国拥有丰富的草地资源，分布于东北平原、内蒙古高原、鄂尔多斯高原、黄土高原以及青藏高原等各类天然草地，约有4亿hm2，占全国国土面积的41.7%［31］。内生真菌分布广、种类多，普遍存在于每种植物中，此外内生真菌所产生的次生代谢物也是多种多样，这对于内生真菌的研究和开发提供了巨大的空间。

近年来，大量相关科技文献的涌现，使得文献计量得到重视。文献计量学是指利用科技文献和信息科学，统计相关文献的数据，并对其进行定量分析，来明确某一研究领域的发展趋势，能够为相关研究人员提供所在领域的发展现状以及研究趋势，能够更好地为研究领域和研究方向的选择提供参考。随着科学研究和技术的不断发展，内生真菌在农业科技应用、绿色农业生产等方面的重要性日益凸显出来。我国在内生真菌方面发表了大量的研究论文，但到目前为止，缺乏对内生真菌以及禾草与非禾草内生真菌发展进程的差距相关文献的系统解读。因此，将基于CNKI数据库对禾草Epichloë属内生真菌和非禾草内生真菌的文献进行计量分析，以明确国内对内生真菌相关领域的研究热点、研究空白、存在的问题以及与国际上内生真菌相关研究存在的差距，为内生真菌的进一步深入研究提供良好的借鉴与参考。

1 材料与方法

以中国知网数据库（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）为数据来源，选用内生真菌为关键词，发表年份为1999年10月31日—2019年10月31日，进行高级检索，共检索到相关的文献5333篇，以此作为文献数据来源，手动挑选与禾草Epichloë属内生真菌研究相关的论文，共挑选到377篇文献。基于文献计量法分析，从论文的发表年份、数量、发表期刊、文献科研机构、所属的学科、研究机构和关键词词频等方面进行统计和比较［32］。其中，对于禾草内生真菌关键词的统计与比较，利用Citespace对377篇的关键词频度进行分析，并构建关系图。

2 结果与分析

2.1 全国禾草与非禾草内生真菌论文发表情况及分析

1999-2019 年，共检索到内生真菌相关文献5333篇，其中禾草内生真菌相关文献377篇。内生真菌年发文量总体呈现不断上升的趋势（图1），但禾草内生真菌的年发文量，变化趋势较小，2014年以前整体呈现上升的趋势，其中2015年达到峰值，年发文量为69篇。从2015年以后又呈现出逐渐降低的趋势。拟合方程为y=2.1558x-4299.2，（其中x为发表文献年份，y为年发文量），R2为0.6457，可表示发表年份与年发文量的关系。而非禾草内生真菌研究相关文献在20年内发文量呈现较大幅度的增加，2016年以前呈现出线性增长的态势，在2016年达到一个峰值，之后稍微有所降低。将非禾草内生真菌文献数量根据所在年度进行数据拟合，得到的拟合方程为y=24.406x-48811，（其中x为发表文献年份，y为年发文量），R²=0.9022，线性拟合程度较好，表明国内学术界对非禾草内生真菌研究的重视程度越来越明显。从20年发文量来看，国内禾草内生真菌的发文数量远远小于非禾草内生真菌。

图1 1999-2019年在CNKI数据库中禾草内生真菌与非禾草内生真菌相关研究论文年发文量Fig.1 Annual publications of research paper s r elated to endophytic fungi of grass and endophytic fungi of non grass in CNKI database during 1999-2019

2.2 发文学科分布

对检索出的5333篇内生真菌相关文献按照一级学科进行分类的结果表明（表1），在生物、作物、中药与方剂研究领域的学科分布相对较高，分别为21.62%，15.58%，14.16%，涉及的学科较为广泛。其次377篇禾草内生真菌相关文献按照一级学科分类的结果发现（表1），在作物、草学、生物、植物保护4个研究方向的论文分别占禾草内生真菌文献总数的20.69%，18.83%，11.94%，10.34%。从以上结果可知，禾草内生真菌与非禾草内生真菌的学科分布在作物学和生物学中都有较大分布。禾草内生真菌的研究由于其宿主都为禾本科草类植物，且禾草内生真菌的有性态表现为香柱病菌，在草学学科和植物保护学科中有较大分布。而非禾草内生真菌的研究有很大一部分来源于次生代谢产物的药物开发，因此在中药与方剂学科中也有较大分布。

表1 1999-2019年期间在CNKI数据库中关于内生真菌与禾草内生真菌相关研究论文的主要学科分布Table 1 Main discipline distribution of research paper s on endophyte and grass endophyte in CNKI database during 1999-2019

2.3 文献期刊分析

对检索到的5333篇内生真菌的文献进行统计分析，其中发文期刊超过总文献10%的有天然产物研究与开发、安徽农业科学、菌物学报以及中国中药杂志（表2），其中禾草内生真菌的发文期刊主要分布在草业科学、草业学报、生态学报等杂志。由此可知，发文期刊种类较为狭小，内生真菌主要发文期刊基本为同一类型的期刊，反映了关于内生真菌的研究较为局限，存在较大的发展空间。

表2 1999-2019年期间在CNKI数据库中内生真菌研究载文量排名前10位的期刊Table 2 Top 10 journals in the CNKI database for endophytic fungi research during 1999 to 2019

2.4 发文量前10位的科研机构或单位

对发文机构和单位统计分析（表3）发现：发文量排在前10位的机构或单位包括：西北农林科技大学、兰州大学、云南大学、海南大学、南京师范大学、中山大学、浙江大学、南京农业大学、贵州大学和吉林农业大学，其中排在第1位的是西北农林科技大学，论文数量为240篇，占所有文献的4.50%，其次是为兰州大学，论文数量为126篇，占2.36%。关于发表禾草内生真菌的机构或单位，排名前两位的分别为兰州大学和南开大学，兰州大学发表禾草内生真菌论文数量109篇，占86.51%。南开大学发表禾草内生真菌的论文占内生真菌论文总数的22.28%。非禾草内生真菌研究论文发文量较多的机构和单位研究机构主要包括西北农林科技大学、云南大学、海南大学和南京师范大学等。通过计量分析可知内生真菌的研究主要集中在一些高校，且非禾草内生真菌的研究机构相较于禾草内生真菌的研究机构广泛。

表3 1999-2019年期间在CNKI数据中与内生真菌相关研究论文数量排名前10位的机构Table 3 Top 10 institutions in the number of papers related to endophytic fungi in CNKI data during 1999-2019

2.5 排名前7位的资助项目

各发表论文所获得的资助项目（表4）表明，资助论文超过100篇的基金项目有3个，分别为：国家自然科学基金、国家重点基础研究发展规划以及国家高科技研究发展计划。此外，高等学校博士学科点专项科研基金、国家科技支撑计划、广东省自然科学基金和海南省自然科学基金等也资助了一定数量内生真菌的研究。国家自然科学基金资助论文数量为1163篇，包括141篇禾草内生真菌论文，以及1022篇非禾草内生真菌论文，表明国家自然科学基金在我国内生真菌的研究发展上起着举足轻重的地位。

表4 1999-2019年期间在CNKI数据库中与内生真菌研究相关论文的主要基金项目Table 4 The main fund pr ojects of paper s related to endophyte r esearch in CNKI database dur ing 1999-2019

2.6 单篇论文被引次数排名前10位论文

在检索到的5333篇关于内生真菌的研究论文中，被引频次最高的论文为郭良栋［2］于2001年发表于《菌物系统》的《内生真菌研究进展》一文，被引频次高达819次（表5）。其次为张集慧等［11］于1999年发表于《中国医学科学院学报》的《兰科药用植物的5种内生真菌产生的植物激素》一文，被引频次为446次。其他被引频次较高的论文分别发表于《中草药》《微生物通报》《中国药学杂志》《西北植物学报》和《中山大学学报》等杂志。

表5 1999-2019年期间在CNKI数据库中发表关于禾草内生真菌与非禾草内生真菌相关研究论文中单篇被引用次数排名前10位的论文Table 5 Top 10 papers on the number of citations of a single paper related to endophytic fungi of grass and endophytic fungi of non gr ass in CNKI database in 1999-2019

关于禾草内生真菌的研究论文，被引频次最高的论文为南志标等［14］于2004年发表于《生态学报》的《禾草-内生真菌共生体在草地农业系统中的作用》一文，被引频次为172次。其次为陈世苹等［33］于2001年发表于《应用于环境生物学报》的《水分胁迫下内生真菌感染对黑麦草叶内保护酶系统活力的影响》一文，被引频次为142次，其他被引频次较高的论文分别发表于《江苏农业科学》《植物生态学报》和《微生物学通报》等杂志。引用次数排名前10的禾草内生真菌研究论文中，有5篇是关于黑麦草内生真菌的研究，表明黑麦草内生真菌共生体是国内关于禾草内生真菌研究起步较早的共生体。

2.7 禾草内生真菌高频关键词

关键词是对论文的研究内容、方法、对象等的高度总结，关键词分布可知相关研究领域的研究热点以及发展趋势。利用Citespace软件对377篇禾草内生真菌文献的关键词构建了知识图谱，结果表明，目前国内关于禾草内生真菌的研究对象多集中在醉马草、黑麦草、野大麦、高羊茅、羊草（Leymus chinensis）、中华羊茅等几种禾草（图2）。其他高频词包括了“抗逆性”和“多样性”等，表明目前国内关于禾草共生体的研究多集中在禾草内生真菌共生体的生物抗逆和非生物抗逆机理，以产生生物碱的功能为研究基础，通过菌株多样性的研究筛选获得优良的内生真菌菌株以及新的禾草-内生真菌共生体的挖掘。

图2 1999-2019年期间在CNKI数据库中与禾草内生真菌研究相关的高频关键词网络关系图Fig.2 Network diagram of high frequency keywords related to the study of endophytic fungi of grass in CNKI database during 1999-2019

3 讨论与展望

文献作为信息、科技的载体，其数量可反映研究人员对内生真菌相关研究领域的关注程度和投入程度，我国非禾草内生真菌年发文量远大于禾草内生真菌，在国际上，关于禾草内生真菌的发文量在1996-2016年达到1042篇，其中我国含有66篇［32］，占到国内发文量的27.5%，对我国禾草内生真菌研究占有重要影响。本研究发现对于内生真菌的研究局限于少数几个学科，急需更加深入地交叉研究以推动研究思维的变革和创新，来挖掘研究领域的巨大潜力。此外任何一个领域的研究都离不开国家的支持，而在内生真菌的研究上，尤其是禾草内生真菌，基金项目较为缺乏且研究机构较为集中，主要为西北地区，使得研究的广度、深度都有待加强。2018年师茜等［32］基于Web of Science数据库对禾草内生真菌研究论文进行计量分析，列出了引用频次排名前10论文的关键词，研究对象主要是醉马草和羽茅（Achnatherum sibiricum），研究内容主要为内生真菌提高宿主植物的抗旱性、抗寒性、抗盐性的生理生化机制，本研究发现与其较为一致。

在20年的研究中我国取得了巨大进展，发现了越来越多的Epichloë属［47-48］内生真菌，深入了解和认识到内生真菌的系统发育过程，分子生物学技术、基因组学、蛋白组学和代谢组学以及信息生物技术的应用加快了内生真菌的研究，其次内生真菌全基因族测序的测定，更是明确了次生代谢物多样性及其基因的关系［49-50］。在目前，禾草内生真菌的研究主要集中在黑麦草、高羊茅等，对于其他菌株还需要深入研究其进化起源以及与宿主植物的关系［51-52］。我国加大了对禾草内生真菌多样性的研究，但仍较为局限，且鉴定的精确度不高。其次，我国对于内生真菌的研究主要集中在内生真菌提高宿主对环境抗逆性的生理生化机制，以及生物碱对生态系统的影响和内生真菌所产生的次生代谢物的作用等方面。而在国际内生真菌的研究更多集中在内生真菌与寄主相互作用的分子机制，以及利用内生真菌来进行育种等方面［51］，并已经选育出禾草内生真菌共生体新品种并应用于市场，而我国起步较晚，投入程度还远远不够。再者，利用内生真菌共生体所产生的次生代谢物将其开发成杀菌剂，杀虫剂等，内生真菌共生体所产生的麦角新碱具有消炎、止痛等功效，可用于药物的制作等［8］都具有巨大的研究潜力。

续表5 Continued Table 5

内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，从长春花（Catharanthus roseus）所分离出的内生真菌菌株中，可发现含有长春新碱成分，这种成分具有抗肿瘤活性，且对白血病具有显著疗效［41，53］。此外内生真菌可能通过分泌2，3-丁二醇以及类似物来调控拟南芥（Arabidopsis thaliana）自 身 合 成 生 长 素（auxin，IAA），调节生长素相关运输蛋白运输生长素到指定位置以促进拟南芥的生长［54］，在未来可以利用该特性开发生物菌肥，对提高品种及产量具有巨大潜力。一些内生真菌能够产生细胞壁分解酶，能用于克服宿主防御异物的天然屏障，还可产生果胶酶等胞外酶［55］，产生较高的商业价值。植物内生真菌是一个特殊的真菌类群，而目前对于非禾草内生真菌的研究主要集中在药用植物。近年来，我国已从数百种药用植物中分离鉴定出大量的内生真菌，主要研究内生真菌对宿主的生长发育、种子萌发、有效成分积累等方面的作用［56-57］，但对于内生真菌与宿主相互关系的分子机制研究成果较少以及对于内生真菌的研究主要集中在实验阶段，实际应用还需深入研究和实践。因此同样要加强非禾草内生真菌的共生机制和抗逆机制的研究，加强内生真菌与药用植物天然产物的研究，加强内生真菌同预防医学、中医药学和林学等相关学科和团队的研究。

内生真菌共生体对其他微生物同样也产生一定影响，Márquez等［58］在研究中发现，只有被病毒感染的内生真菌才能提高寄主植物的耐热性，这揭示了真菌病毒能影响内生真菌共生体系，但病毒对内生真菌以及共生体的影响仍不清晰。菌根真菌同样能与植物根系建立互惠共生关系，而内生真菌与菌根真菌双重感染时对寄主植物所产生的影响研究较为缺乏。有研究表明内生真菌与菌根真菌存在拮抗作用［59］，但在某些情况下反而促进菌根真菌的侵染［60］。两种真菌是否形成双重共生体以对寄主达到多方面的保护，仍需更深入的探索。因此对于我国内生真菌的相关研究需要加大投入，以不断提升该领域的研究水平，推动我国内生真菌的发展。