液质联用法分析陈皮中41 种农药残留

李 纯，任 晋，熊 颖，栗建明，顾利红

（广州市药品检验所，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广东 广州 510160）

陈皮为芸香科植物橘Citri reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮，分为“陈皮”和“广陈皮”［1]。近年来，陈皮在药品、食品、化妆品工业用途开发广泛［2-8]，品质与安全的保障需要快捷高效的检测方法来满足。柑橘中农药残留主要分布在果皮，其残留量约占全果的80%以上，果肉中残留值很低。目前柑橘类的农药多残留测定方法主要以新鲜柑橘全果或果肉部分为测定对象，大部分采用经典QuEChERS 法［9-14]，该方法更适用于水果柑橘类农残检验。陈皮富含色素及小分子挥发油，纤维及淀粉含量、含水量低（小于10%），遇水溶胀性强，吸附作用大，因此在样品前处理方法选择上有别于水果柑橘。考虑到方法的通用及简便、快速，主要采用乙腈直接提取浓缩法同时参考QuEChERS 原方法、美国AOAC2007.01 法［14]等对净化方法进行了筛选。本实验选择适用于液相质谱联用仪的41 种农药，根据陈皮基质的性质特点建立具有针对性的前处理方法以满足农药多残留检测要求。

1 材料

1.1 仪器 3200 QTRAP 质谱联用仪（美国ABsciex 公司，分析软件Analyst 1.6.3）；1200 高效液相色谱（美国Agilent 公司）；AG245、XP-26 电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HS260 控制型往复振荡摇床（德国IKA 公司）；Maxi MixⅡ涡旋混合器（美国Thermolyne 公司）；Milli-Q 超纯水制备系统（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 41 种农药化合物对照品（纯度≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。乙腈、丙酮（色谱纯，德国Merck 公司）；内标磷酸三苯酯（纯度≥98%）、醋酸、乙酸氨（色谱纯）、氯化钠、无水硫酸镁（农残级）、吸附剂N-丙基乙二胺和十八烷基键合硅胶，均购自上海安谱科技有限公司。57 批陈皮购自药材市场，经广州市药品检验所顾利红主任中药师鉴定为正品，均符合2015 年版《中国药典》 一部规定，粉碎，过3 号筛备用。

2 方法与结果

2.1 LC-MS/MS 条件 菲罗门Kinetex C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）及预保护柱（4 mm×2.0 mm，2.6 μm）；流动相95%乙腈（含5 mmol/L 甲酸铵和0.1%甲酸，A）-水（含5 mmol/L 甲酸铵和0.1%甲酸，B），梯度洗脱（0～1 min，30% A；1～12 min，30%～100% A；12～14 min，100%A；14～15 min，100%～30%A；15～20 min，30%A）；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；样品盘温度20 ℃。

电喷雾（ESI）离子源，正离子模式；依赖保留时间的多反应监测模式（Scheduled MRM）；检测窗60 s；气帘气（CUR）30 psi（1 psi=6.895 kPa）；碰撞气（CAD）8 psi；喷雾电压（IS）5 500 V；离子化温度（TEM）600 ℃；雾化气（GS1）50 psi；辅助气（GS2）50 psi。其他参数见表1。

表1 41 种农药残留及内标的离子对参数及碰撞电压

2.2 供试品溶液制备 取样品粉末约3 g，精密称定，置50 mL 聚苯乙烯聚塞离心管中，加入0.3 g 氯化钠，立即摇散，加入20 mL 乙腈，振荡提取30 min，离心5 min（4 000 r/min），取上清液，同法提取2 次，合并提取液，40 ℃水浴中浓缩至3～5 mL，转入10 mL 量瓶，用少量乙腈多次洗涤瓶壁，洗涤液一并转入量瓶，乙腈定容至刻度，混匀。量取上述提取液8 mL，转移至装有1.2 g 无水硫酸镁、300 mg 十八烷基键合硅胶、100 mg N-丙基乙二胺吸附剂的10 mL 塑料离心管中，涡旋混匀5 min，离心5 min（4 000 r/min），即得。

2.3 内标溶液 精密称取磷酸三苯酯适量，乙腈制成0.2 mg/mL溶液，临用前用水稀释至0.20 μg/mL，即得。

2.4 空白基质制备 取不含农药的空白陈皮样品，按“2.2”项下方法制备，即得。

2.5 基质混合标准工作溶液 单一对照品用丙酮制成100 μg/mL单标贮备液，精密量取1 mL，乙腈定容至50 mL，制成2 μg/mL 溶液，临用前用乙腈制成不同质量浓度。取空白陈皮基质，配制不同质量浓度（1、2、5、10、25、50、100 ng/mL）的溶液，即得。

2.6 测定方法 精密取系列质量浓度的基质混合标准工作溶液、供试品溶液各1 mL，精密加入0.3 mL 内标溶液，混匀，过0.22 μm 微孔滤膜，精密吸取2.0 μL，注入液质联用仪，内标标准曲线法计算供试品中41 种农药残留量。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性考察 采用混合标准溶液加陈皮空白供试品基质配成的混合标样（50 ng/mL），对各色谱峰进行定位、确认，发现提取试剂、材料对供试品中各色谱峰无干扰，方法专属性良好，见图1。

图1 各样品TIC-MRM 色谱图

2.7.2 基质效应考察 考察41 个农药残留的基质效应，质量浓度为10 ng/mL，发现34 个符合要求（80%～120%），其中甲胺磷、咪鲜胺等4 个低于50%；多菌灵、单甲脒受基质轻度抑制，为50%～80%，这可能与陈皮中含挥发性小分子物质较多，更容易竞争性占据离子化位点有关。为尽可能地消除基质效应的影响，减少测定结果的误差，采用基质匹配内标校准曲线对样品中的农药残留进行定量。

2.7.3 线性关系考察 以对照品与内标物峰面积比值为纵坐标（Y），对照品与内标物质量浓度比值为横坐标（X）进行回归，权重系数1/x。结果表明，r 在0.994 0～0.999 6之间，各农药残留在各自范围内线性关系良好。再逐步稀释对照品基质溶液至各待测指标信噪比为3～5，测得方法定量限（LOQ）在0.7～26.7 μg/kg 之间。

2.7.4 加样回收率试验 设定加标质量浓度3 个水平分别为20、50、100 μg/kg，各平行处理6 份，代入随行标准曲线计算。结果，41 个农药残留的平均加样回收率68.9%～110.0%，RSD 0.1%～14.1%。取基质配制标准工作溶液（质量浓度为25 ng/mL）1 份，重复进样6 次，测得各待测物与内标的峰面积比值RSD 1.9%～10.9%。

3 结果与分析

购自药材市场的57 批样品一共检出13 类农药，检出率较高的基本为杀菌保鲜剂、杀虫剂、杀螨剂，共10 种，均超过40%，可见在陈皮种植过程中农药种类使用广泛。具体见表2，方法学考察结果见表3。

表2 阳性样品测定结果

表3 各农药残留方法学考察结果

共检出4 种属于国家农业农村部明令禁止的农药，分别为克百威（克百威与3-羟基克百威总和）、甲胺磷、硫线磷、治螟磷，均为广谱杀虫剂。国家药典委员会于2019年8 月27 日发布2015 年《中国药典》 四部“0212 药材和饮片检定通则”修订草案公示稿中，33 类禁用农药规定不得检出（低于定量限）［15]，根据此限度，共10 批样品检出克百威超限（超限率18.0%），其余3 种不超限。杀扑磷为柑橘类果树中禁止使用的农药，残留量0.01～3.2 mg/kg，数量相差320 倍，提示部分农户存在违规使用禁用农药的现象。

咪鲜胺是柑橘在储存运输中使用的抑菌保鲜剂，57 批样品中检出28 批，检出率49.1%，参考“GB 2763—2016食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量”［6]中柑橘残留限度5 mg/kg，有9 批超限，超限率15.7%，均为当年产的新皮，课题组调研结果证明，部分药用陈皮来源于柑橘取完果肉后废弃果皮进一步加工制成，是其副产品之一。药用陈皮无需保鲜，而柑橘采收时间比其滞后，导致果皮营养物质流失。因此，可考虑制定咪鲜胺限量以控制柑橘弃皮被当做药用陈皮的情况。

4 讨论

本实验尝试用经典QuEChERS 方法的醋酸水及直接乙腈2 种提取方式。陈皮粉末加入水浸泡，溶胀情况十分严重，溶出色素及杂质较多，对部分待测指标色谱峰造成干扰。由于待测目标成分的结构差异大、极性范围广，考虑到方法的便捷性及通用性，本品采用乙腈作为提取溶剂，样品经乙腈2 次振荡提取，合并提取液后低温旋蒸浓缩，部分待测指标对温度敏感，因此旋蒸温度不高于40 ℃。

QuEChERS 方法的通用性在于，根据基质特性以及不同的待测指标，灵活挑选搭配不同比例的吸附剂达到净化目的［16-18]。课题组在净化材料的选择与配比方面做了部分探索。净化填料含1.2 g 无水硫酸镁，N-丙基乙二胺和十八烷基键合硅胶总量共400 mg。结果显示，0.4 g N-丙基乙二胺对磺隆类农药吸附作用大，回收率偏低（甲磺隆19.8%、氨苯磺隆8.4%、苯磺隆50%、氯磺隆21.2%），因为磺隆类农药含酰氨键，与N-丙基乙二胺的氨基形成氢键作用造成吸附；0.4 g 十八烷基键合硅胶对除去挥发油效果好，但是丁硫克百威几乎全部被十八烷基键合硅胶吸附，回收率仅为0.29%，因为丁硫克百威含硫原子，脂溶性大，难以洗脱。当0.1 g N-丙基乙二胺和0.3 g 十八烷基键合硅胶时，90%以上待测农药回收率在70%～116%之间，达到痕量分析的要求。

本研究建立了经改良型QuEChERS 净化的高效液相色谱-串联质谱同时测定陈皮药材中41 种农药残留的检测方法。该方法简单高效、重复性好、准确度高，为可用于陈皮药材的日常监控、残留限度制定及风险评估等。