电刺激调控干细胞心肌向分化和心肌修复

高娅娅， 李沂蒙， 毛吉富， b， c， 王 璐， b， c

(东华大学 a.纺织学院； b.纺织面料技术教育部重点实验室； c.纺织行业生物医用纺织材料与技术重点实验室， 上海 201620)

心血管疾病是导致人类死亡的主要疾病之一，我国每年死于心肌梗死及其并发症的人数已超过100万，且发病率逐年攀升[1]。在受到诸如心肌梗死等的严重损伤后，因心肌细胞的再生潜力有限，随着时间流逝，纤维化瘢痕组织取代了存活心肌，并且左心室扩张，最终导致心力衰竭。当前治疗末期心力衰竭的最新方法主要是应用左心室辅助设备进行全心脏移植[2-4]，但这些治疗手段仍面临侵入性手术、供体器官有限的现状以及免疫排斥等问题。因此，临床上迫切需要一种新疗法来治疗心肌梗死导致的心力衰竭。

基于干细胞的心肌修复疗法展现出广阔的应用前景。由干细胞分化而来的心肌细胞，被视为治疗心肌梗死最有希望的细胞来源。然而，由干细胞定向诱导分化形成的心肌细胞尚未完全成熟，且具有搏动频率变异性问题，其被移植到受损心脏后存在心律失常的风险，无法执行正常心肌细胞的功能[5-6]。在心脏收缩过程中，起搏器细胞负责产生电脉冲或动作电位，从窦房结发出节律性电信号，通过细胞间隙连接传播至心肌层细胞，再通过高导电性的浦肯野纤维传导至心脏其他区域，最终实现整个心脏的节律性收缩[7]。在此过程中，电信号和间隙连接对心脏的同步搏动至关重要。近些年，电刺激因其非药物治疗手段以及在疾病治疗方面的安全、方便、经济特点而受到广泛关注。研究发现，一定范围的电刺激能够促进干细胞向心肌细胞的诱导分化以及干细胞源心肌细胞的体外成熟。心肌梗死发生后，心脏功能逐步衰退，收缩期左心室内部尺寸明显扩大，心室壁心肌组织完全被纤维化组织取代。动物试验结果表明，体外经电刺激培养成熟的心肌细胞能够减少梗死区的梗死面积和纤维化组织，并促进血管再生[8]。

本文介绍2种导电材料基电刺激平台，聚焦2种常见的电刺激模型，对电刺激促进干细胞心肌向分化及心肌细胞的成熟和功能化研究进行总结。

1 导电材料基电刺激平台

在心肌细胞电刺激系统中，大多数电刺激装置通过插在培养液中的2个电极为细胞提供电场刺激。该类电刺激装置过于简单，无法有效地向心肌细胞传导电信号。研究发现，接种于导电微纳复合支架上的心肌细胞对电刺激的响应较高(见图1)[9]，能够有效传导电信号，可促进心肌细胞的同步搏动功能。目前，用于工程化心肌组织体外构建的导电生物材料主要包括导电水凝胶[10]和导电纳米纤维支架[11]。

图1 人间充质干细胞电刺激生物反应器示意图[9]Fig.1 Schematic of the bioreactor for hMSCs electrical stimulation[9]

1.1 导电水凝胶

水凝胶能够在水中溶胀、可保持大量水分而又不溶解于水，具有良好的生物相容性和可控的力学性能，由于存在大量的亲水基团，其含水率高达90%以上[12]。水凝胶因其三维网络结构与体内心肌细胞所处基质微环境相似，被广泛应用于工程化心肌组织的体外构建[12]。

Zhao等[13]将心肌细胞包埋在纤维蛋白水凝胶中，提高了心肌细胞的间隙连接蛋白表达及收缩力，改善了心肌组织的功能，但未能改善心肌细胞对电信号的传导。近些年新型导电生物材料得到广泛开发，通常是将水凝胶与导电材料复合起来，以制备具有导电性能的水凝胶材料。常用的导电材料包括碳纳米管(CNT)[14]、石墨烯[15]、导电聚吡咯(PPy)[16]、聚苯胺[17]、金纳米颗粒[18]等。Shin等[14]将新生大鼠心肌细胞接种到掺有CNT的光交联甲基丙烯酸明胶水凝胶上以设计功能性心肌补片，结果表明，所得心肌补片具有明显改善的电生理和力学性能，可促进心肌细胞的黏附和成熟、改善心肌细胞间的电耦合。但潜在的生物毒性限制了碳纳米材料的进一步应用。导电聚合物因具有良好的生物相容性，在生物医学领域得到了广泛的应用。Wang等[16]用贻贝启发性多巴胺交联剂将PPy纳米颗粒、明胶-甲基丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯整合成冷冻凝胶形态，并将心肌细胞种植在该导电水凝胶上，结果显示导电水凝胶显著增强了心肌细胞的附着、扩散能力以及细胞活力。然而，导电聚合物不易降解的特性限制了其在组织工程中的应用。Kashi等[19]用吡咯低聚物开发了一种新型可注射的导电水凝胶，该水凝胶具有优异的导电性和生物可降解性，良好的生物降解性能有助于其在心肌组织工程中的应用。目前，可注射水凝胶因其可负载药物和细胞的能力而受到广泛关注[20-22]。作为在梗死区输送细胞和药物的载体，水凝胶可保护细胞和药物免受恶劣微环境的侵害，这对新血管形成和心肌再生至关重要。然而，通过化学凝胶法制备的可注射导电水凝胶体系中通常含有残留的单体、引发剂或交联剂，而部分残留剂如戊二醛对细胞有毒[23]。物理交联可注射水凝胶由于细胞毒性较小受到了广泛的关注，因此物理交联可注射水凝胶的开发将是未来研究心肌修复生物材料的一个重要方向。

1.2 导电纳米纤维支架

组织工程支架的关键作用在于引导细胞黏附、扩散、增殖以及促进组织修复[24]。纳米纤维可以仿生细胞外基质的纳米丝状结构，平均直径为50～500 nm[12]。作为电刺激平台，导电纳米纤维支架能够与细胞产生较好的相互作用，且其较高的比表面积可为细胞培养提供充足的空间[12]。基于这些特点，纳米纤维支架在心肌组织工程再生领域显示出极为广阔的应用前景。

天然材料如蛋白质或多糖因易于被细胞识别而受到再生医学领域的关注，用于组织工程支架的天然材料主要包括纤维素[25]、胶原[26]、天然丝[27-28]等。Tsui等[27]开发了由丝素蛋白-PPy导电底物制成的具有生物相容性的心脏支架，该底物具有纳米脊和凹槽的图案，可模拟天然心肌细胞外基质的结构，从而增强人多能干细胞源心肌细胞的生物学特性。然而，天然生物材料在用作心肌组织工程支架时要经历繁琐的纯化技术，并且其被用作异种移植物或同种异体移植物时可能诱发免疫反应[29]。这些局限性促使研究者转而探索合成生物材料。心肌组织工程支架制备中应用最多的合成材料是聚酯类人工合成高分子，包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)[30]和聚己内酯(PCL)[11]等。Song等[30]将PGA外科缝合线设计成弹簧状线圈(见图2(a))，通过多巴胺涂层(DOPA)增加PPy的黏附力；在体外接种心肌细胞后发现，心肌细胞沿着弹簧线圈轨道生长，呈细长形且出现高度定向的肌节，并伴随心脏特异性蛋白α-肌动蛋白和连接蛋白CX43的高表达(见图2(b))；将其注入发生心肌梗死的小鼠体内后发现，缩短分数和射血分数增大，梗死面积减小。在心肌组织工程研究中，将工程化的心肌组织植入体内后需对其性能进行监测。聚偏二氟乙烯(PVDF)因其优异的压电性能、柔韧性和生物相容性而被用于监测工程心脏组织的收缩[31]。Nofar等[31]制备了一种基于PVDF的纤维状支架(见图2(c))，其具有生物支架和传感器的双重功能，可测量由心脏组织产生的收缩，并且能够将多能干细胞分化为心肌细胞，通过心脏特异性蛋白的高表达和心脏收缩功能的改善促进心肌细胞成熟。然而，纳米纤维支架较弱的力学性能限制了其在心肌修复领域的应用。通过改性提高纳米纤维支架的力学性能将是未来开发纳米纤维支架的一个主要研究方向。

2 电刺激模型

研究发现，外加电刺激可使心肌组织产生响应并达到同步收缩，而电信号的这种兴奋-收缩耦合对心脏的功能发育有着重要的促进作用[32]。电刺激会影响心肌细胞动作电位的产生与持续时间以及心肌细胞的搏动频率，可增大具有自发搏动能力的细胞比例，从而促进细胞的同步跳动[33]。电刺激模型主要包括直流电刺激和脉冲电刺激。

2.1 直流电刺激

直流电疗法是使用低电压平稳直流电通过人体一定部位治疗疾病的方法，是最早应用的电疗法之一。直流电刺激具有促进细胞生长和引导细胞趋向的作用。对组织细胞进行直流电刺激，可改变兴奋细胞对Na+或Ca2+的通透性，从而产生动作电位，促使细胞内部的Na+、 K+离子通道发生变化而引起内部环境的改变，最终改变细胞的状态[34-35]。

Thrivikraman等[36]将细胞接种在PANI-GNP导电膜上并以100 mV/cm的直流电和脉冲电刺激触发人间充质干细胞的神经源性/心肌源性分化。结果表明：施加直流电刺激时，细胞内Ca2+通过L型钙通道进入细胞，该过程与神经元Ca2+内流同时发生，大多数人间充质干细胞获得更长的丝状延伸，并趋向神经元定向分化；施加脉冲电刺激时，细胞表现出迟滞的快速钙瞬变，类似参与调节肌肉基因表达的Ca2+信号，大多数人间充质干细胞更倾向于心肌向分化。在上述条件培养的人间充质干细胞中，钙反应的动力学差异说明这些钙信号在驱动细胞选择性分化中发挥的作用不同。现有研究较多使用脉冲电刺激探究电刺激对干细胞心肌向分化及心肌细胞成熟的作用。

(a) DOPA涂层的PPy/PGA三维心肌补片制备[30]

(b) 将DOPA涂层的PPy/PGA弹簧注入心肌梗塞小鼠体内[30]

(c) 具有生物支架和传感器双重功能的PVDF心肌补片制备[31]

2.2 脉冲电刺激

脉冲电刺激根据电流方向是否改变分为单相脉冲和双相脉冲。研究[37]表明，不同方向脉冲对心肌细胞的成熟和功能化作用有所不同。郑丽娜等[38]对小鼠胚胎干细胞施加5 d单相脉冲(电压为10 V、频率为0.5 Hz、脉宽为5 ms)，结果显示，由电刺激组胚胎干细胞分化得到的心肌样细胞搏动更快、更趋于一致，由胚胎干细胞诱导分化得到的心肌细胞的心肌肌钙蛋白T(cTnT)荧光染色阳性率更高。但是连续的单相脉冲会引起电极的直流极化进而产生电化学副作用，易损伤细胞并腐蚀电极，而使用双相脉冲可以避免这些问题。Richards等[39]用双相脉冲(电场强度为2.5 V/cm、频率为1 Hz、脉宽为5 ms)电刺激人多能干细胞(hPSCs)源心肌细胞，结果显示，电刺激促进了间隙连接蛋白的表达，增加了hPSCs的自发搏动频率。为比较单相和双相电场刺激对体外培养心肌细胞结构和功能的影响，Chiu等[40]设计了一种生物反应器，通过对新生大鼠心肌细胞分别施加双相方波脉冲(电场强度为2.5 V/cm、频率为1 Hz、脉宽为1 ms)以及具有相同总幅度和持续时间的单相方波脉冲(电场强度为5 V/cm、频率为1 Hz、脉宽为2 ms)，结果表明，双相脉冲刺激组的细胞密度与同步收缩率更高，CX43的表达水平更高，但是双相脉冲中的次级脉冲超级化可能会干扰动作电位的启动[41]。

此外，通过优化脉冲电刺激参数也可获得更成熟、活性更强的体外心肌细胞。Tandon等[42]对新生大鼠心肌细胞施加脉冲电刺激时，通过改变电极材料、刺激幅度和频率来确定最适合心脏组织工程的电刺激参数。结果表明，脉冲电刺激参数为碳电极、振幅3 V/cm和频率3 Hz时，工程心脏组织的密度最高、cTnT和CX43表达最多、收缩作用最强。现有研究虽然已经探究了脉冲电刺激参数对心肌细胞生长的影响，但未考虑脉冲电刺激参数对心肌细胞同步收缩的作用。因此，未来可通过结合灌注策略与电刺激促进心肌组织的同步收缩。

3 电刺激促进干细胞心肌向分化

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的未分化细胞，是形成哺乳类动物各组织器官的原始细胞[43]。由干细胞分化而来的心肌细胞被视为建立心脏药理模型及进行心肌细胞治疗最有希望的细胞来源。常见的干细胞来源包括胚胎干细胞(ESCs)、多能干细胞(PSCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)、间充质干细胞(MSCs)等[13]。研究表明，在电刺激和分化因子共同作用下，干细胞具有向心肌细胞分化的潜能，主要表现为细胞形态发生变化、心脏转录因子表达增加及细胞内活性氧水平升高[44-50]。

3.1 电刺激作用下细胞形态的变化

干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，体积较小，细胞核较大且多为常染色质，具有较高的端粒酶活性。人类成年心肌细胞具有独特的各向异性棒状结构，长宽比为7∶1。在干细胞心肌向分化过程中，电刺激作用使得心肌细胞形态拉长，细胞表面积和体积增大[44]，细胞超微结构的成熟度发生变化。成年心肌细胞具有排列整齐的肌节结构、较高的肌原纤维密度以及成熟的线性Z盘结构[45]。

Wang等[45]研究发现，石墨烯微片能促进hPSCs分化为功能性心肌细胞，具体表现为石墨烯底物可改善心肌细胞的表型，即出现较多棒状细胞，其中双核细胞数量明显增多，且具有更成熟的线性Z盘结构，并且肌原纤维密度显著增加。上述石墨烯导电底物通过内源电信号的刺激促进了干细胞的心肌向分化，而外源电信号的刺激能更好地实现这一目标。Eng等[46]连续7 d对ESCs来源的心肌细胞分别施加0.5、 1.0、 2.0 Hz的脉冲电刺激，结果显示：在超微结构水平上，未刺激细胞的肌节短而无序；2.0 Hz电刺激组中细胞的肌原纤维平行排列，呈非常发达的条纹超微结构，并且具有连续的厚肌节亚基的重复序列。现有研究多是针对单独内源或单独外源电信号对细胞分化的影响，而未对两者的耦合作用做深入研究，因此，内、外源电信号联合刺激将是未来促进干细胞心肌向分化的一个主要研究方向。

3.2 电刺激促进心脏转录因子表达

转录因子是能直接或间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，近年来转录因子Nkx2.5、 GATA-4、 cTnT、 SERCA、Tbx5和Hand2等陆续被发现[47]。其中，转录因子Nkx2.5和GATA-4与心脏发育有着密切联系。Nkx2.5参与心脏的成形，包括右侧环化、心腔分化以及心脏间隔功能成熟，在心脏发育和保持出生后心脏稳态，特别是在心脏功能成熟以及工作心肌和心脏传导的功能维持等方面起到重要作用[48]。GATA-4的表达对内胚层的分化和腹部形态的成形而言必不可少，GATA-4蛋白水平过低将导致心肌细胞复制减少、心肌发育不全和心内膜垫缺损[49]。

研究表明，电刺激可促进干细胞分化过程中心脏转录因子的表达。Chan等[51]使用八通道C-Pace刺激器(电场强度为6.6 V/cm，脉冲频率为1 Hz、脉宽为2 ms)在施加与未施加电场刺激的情况下，对培养了4 d的ESCs来源的心肌细胞进行分子分析和功能分析，定量聚合酶链反应显示电刺激组SERCA、NKX2.5和GATA-4的高表达促进了ESCs向心肌细胞的分化。研究表明，对接种在导电材料上的干细胞施加电刺激能更好地促进心脏转录因子的表达。Ahadian等[52]将碳纳米管嵌入小鼠胚状体并使用C-Pace EP慢性细胞刺激器(电场强度为3 V/cm，脉冲频率为1 Hz、脉宽为10 ms)电刺激小鼠干细胞，结果表明，未施加电刺激时载有碳纳米管的小鼠胚状体中Nkx2.5、cTnT、Myh7和GATA-4的表达明显高于对照组，施加电刺激后进一步增强了心脏转录因子的表达。然而目前尚不明确电刺激促进心脏转录因子表达的调控机制，未来仍需进一步探究电刺激作用下心脏转录因子表达水平变化的机理。

3.3 电刺激促进活性氧水平升高

干细胞对电刺激反应的一个重要机制是产生活性氧(ROS)，主要由NADPH-氧化酶催化产生。生成的ROS可促进参与分化的其他信号分子的表达[53]。研究表明，在电刺激作用下ROS的激活是促使干细胞增殖和分化的重要因素[54]。Wolf-Goldberg等[55]研究发现，当在生理溶液中施加较高电场强度的刺激时，在阳极-电解质界面会产生ROS和其他自由基。由此可见，暴露于电场刺激时，细胞内ROS水平的升高有助于干细胞的分化。

4 电刺激促进心肌细胞的成熟和功能化

由干细胞分化而来的心肌细胞尚未完全成熟，将其移植到心肌梗死大鼠心脏后很难实现对心肌梗死区域的修复。研究表明，电刺激能够促进心肌细胞的成熟和功能化，具体表现为电刺激对心肌细胞体外功能的改善以及对心肌梗死大鼠心脏功能的修复。

4.1 电刺激对心肌细胞体外功能的影响

4.1.1 电刺激对心肌蛋白表达的影响

研究表明，在导电基质上施加电刺激能够促进心肌细胞的功能化，即心肌细胞的成熟和同步收缩。同步收缩能力主要基于心脏特异性蛋白如α-肌动蛋白和CX43的表达[16]。α-肌动蛋白可参与心肌细胞的成熟和肌肉收缩的调节；CX43蛋白是一种间隙连接蛋白，主要负责心肌细胞的电收缩偶联和同步收缩。间隙连接蛋白的正常表达对心脏的同步搏动和泵血功能起着重要作用[15]。发生心肌梗死后，心脏纤维化和心肌细胞中间隙连接表达的缺失致使间隙连接重塑，很可能导致心律不齐。提高CX43蛋白表达可减轻心肌梗死后心律失常的可能。

Radisic等[56]使用脉冲电信号(矩形、电场强度为5 V/cm、频率为1 Hz、脉宽为2 ms)连续5 d刺激新生大鼠心肌细胞，结果表明，细胞的α-肌动蛋白和CX43水平升高，收缩力和线粒体含量增加。此外，细胞外基质微环境也是影响心肌细胞功能化的重要因素。在生物医学应用领域，生物材料的表面特性尤为重要，如表面的拓扑结构和表面化学物质对细胞行为起着决定作用。Au等[57]结合形貌和电刺激，在微槽聚苯乙烯上培养的新生大鼠心肌细胞显现出成熟的迹象，并且细胞形态拉长，在细胞-细胞接触区域处出现了间隙连接。为更好地模拟细胞内的三维环境，Wang等[58]将心肌细胞培养在三维生物材料上，结果表明，即使不施加电刺激，三维培养系统也能促进与心肌功能相关蛋白的表达，而电刺激可使这些结果得到进一步改善。现有文献报道针对电刺激和细胞微环境联合作用的研究较少且不够深入，未来可深入探究两者联合作用对细胞功能化的作用。

4.1.2 电刺激作用下Ca2+浓度的变化

在成熟的心脏组织中，电信号通过细胞内、外的离子交换激活，并通过间隙连接传播[59]。作为细胞内信号转导系统的第二信使，Ca2+具有调节细胞功能、参与细胞信号跨膜传递和介导细胞对外界刺激的应答等作用。在正常状态下Ca2+主要存在于细胞外，而细胞内游离的Ca2+浓度很低[60]。

心肌梗死模型中，钙稳态遭到严重破坏，钙处理蛋白的改变及超微结构的改变影响了钙瞬变，继而影响钙信号和心脏收缩功能。在心肌梗死过程中，肌浆网释放的钙减少且不规律[59]。研究表明，适宜的电刺激可使细胞外的Ca2+内流从而使细胞内的Ca2+浓度升高，即在外加周期性电场作用下，细胞膜去极化从而激活电压门控型Ca2+通道，导致Ca2+内流，而细胞内Ca2+浓度增加又加速了细胞膜的复极化[37]。Holt等[61]对新生大鼠心肌细胞施加脉冲(电场强度为2 V/cm、频率为1 Hz、脉宽为5 ms)刺激4 d，结果显示，刺激组的钙释放率比未刺激组高25.4%；Song等[62]将心肌细胞接种在PPy修饰的壳聚糖多孔膜(SP)上，结果表明，在SP上生长的细胞表现出更高的跳动幅度和相对有节奏的Ca2+波动和更高的Ca2+振幅。总体而言，电信号、钙瞬变和细胞反应之间存在一定联系，但目前尚不明确电刺激介导的Ca2+增加的调控机制，因此仍需探究电刺激作用下Ca2+浓度变化的机理。

4.2 电刺激对心肌梗死大鼠心脏功能的影响

心肌细胞在体外发育成熟后，还要通过动物试验观察其对梗死大鼠心脏功能的影响。发生心肌梗死后，心脏功能逐步恶化，平均缩短分数和射血分数明显降低，收缩期左心室内部尺寸明显扩大，梗死大鼠的心室壁心肌完全被纤维化组织取代。研究表明，将体外经电刺激培养成熟的心肌细胞植入心肌梗死大鼠心脏可增加平均缩短分数和射血分数，收缩期左心室内部尺寸明显减小，纤维化区域减弱，并且可以促进血管再生[63]。

Cui等[20]用戊二醛将PPy与壳聚糖复合起来制得可注射导电水凝胶，将其注入冷冻损伤小鼠体内可促进损伤区域电信号的传导并缩短心室除极持续时间。虽然现有心肌补片可通过传导外部电刺激在一定程度上恢复心肌梗死部位的电信号传导[64]，但其只考虑了静态时心肌补片的导电性能与心肌组织的匹配性，忽略了导电心肌补片因心脏搏动发生变形后相应地会发生电阻变化，这会影响电信号的传输与心肌收缩的一致性。现有研究中制备导电心肌补片最常用的方法是在心肌补片材料表面沉积导电层，但是导电高聚物材料因拉伸变形较小难以与心肌补片基材的拉伸性能匹配，致使拉伸时导电心肌补片往往出现导电层破裂现象，导致电阻发生变化，从而影响外部电信号传输[65]。未来可通过预拉伸、卷积法等赋予导电心肌补片蠕虫状结构、螺旋结构和蛇形结构等，以使导电心肌补片具有应变不敏感性，从而具备导电稳定性，更好地传导外部施加电信号并恢复心肌梗死部位电信号的传导。

5 结论与展望

本文总结了导电材料基电刺激平台以及电刺激在干细胞心肌向分化和心肌修复中的应用。电刺激的非药物治疗手段、安全、经济等积极特性使得电疗法治疗心肌梗死得到广泛的关注。体内、外试验结果表明，在导电基质上施加电刺激可以增强在支架上培养的心肌细胞的分化和成熟，主要表现为电刺激作用下细胞形态发生变化、心脏转录因子表达上调、ROS激活、心肌特异性蛋白表达上调、细胞内相对有节奏的Ca2+波动和更高的Ca2+振幅以及心肌梗死小鼠体内射血分数和缩短分数的提高。

将形貌或3D微环境和电刺激相结合可显著促进干细胞源心肌细胞的成熟，然而目前对这种联合刺激的研究尚成熟，未来可更深入地探究细胞外基质微环境和电刺激对细胞的联合作用。这种联合刺激比单纯电刺激显示出更有益的效果，但是在模拟的细胞外基质微环境和天然心肌细胞微环境中培养的细胞的功能仍有一定差距。心脏本身是处于一个动态的力-电微环境中，因此力学刺激也是影响细胞功能的重要因素之一，力-电耦联合刺激将是未来治疗心肌梗死的一个重要手段。