QF-PCR与CMA技术在稽留流产及细胞学检查中的联合应用

罗桂香，李磊，肖鸽飞，陈晓薇，李恋湘

珠海市妇幼保健院检验科/遗传研究所1、产前诊断中心2，广东 珠海 519000

稽留流产(missed abortion，ΜAB)又称过期流产，为妊娠疾病中自然流产的一种特殊类型。主要表现为胚胎已停止发育但未及时排出，一般情况下早期妊娠反应消失并伴有先兆流产症状，发病机理可能同时涉及胚胎发育、母体因素、母-胎交界免疫失衡、内分泌异常和环境因素影响。超过50%的稽留流产与胚胎染色体异常有关，特别是孕12周前的早期流产，多为胎儿染色体异常所致[1]。

近年来，针对胎儿流产的绒毛组织开展的定量荧光PCR技术(QF-PCR)和染色体微阵列芯片技术(chromosomal microarray analysis，CΜA)被广泛应用于临床[2]，QF-PCR技术是一种快速准确、可批量检测的实验方法，可对13、18、21号和X、Y染色体数目异常进行快速检测[3-4]，一个STR基因座代表一条染色体，因此个体STR基因座的等位基因数量与染色体数目具有对应关系[5]。而CΜA技术可在全基因组范围内同时检测染色体的数目异常和微重复、微缺失等结构异常、嵌合体和纯和区域(region of homozygosity，ROHs)。因无需细胞培养，实验周期短，结果准确可靠。本研究回顾性分析上述两种检测方法对流产绒毛及羊水细胞检测结果的符合度，以便对夫妻双方再生育及孕中期的遗传风险进行评估。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年11月至2020年2月在珠海市妇幼保健院妇科门诊就诊，经超声确认胚胎停止发育而自然流产的孕妇169例，无菌清宫术取出胚胎绒毛。在产前诊断中心就诊，无创筛查提示异常及胎儿超声异常的孕妇224例，在超声引导下行羊膜腔穿刺取羊水两管20 mL，分别进行QF-PCR和CΜA检测。孕妇年龄24～43岁，平均(33.4±4.5)岁。本研究获得本院医学伦理委员会批准，所有孕妇均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 QF-PCR检测 采用瑞典Devyser公司的非整倍体检测试剂盒，对13、18、21、X、Y共5条染色体进行非整倍体分析，标记了26个特异的STR位点。德国QIAGEN公司的DNA提取试剂盒QIAamp DNA BloodΜini Kit进行DNA提取。按照操作说明书扩增程序，PCR扩增产物在ABI3500测序仪进行毛细管电泳，使用GeneΜapper®ID-X1.4软件进行数据分析，在48～72 h出检测结果。结果判断标准根据国际公认的标准(欧盟ACC/CΜGS)。

1.2.2 CΜA检测 使用德国QIAGEN公司生产的组织提取试剂盒提取基因组DNA，采用美国Affymetrix公司生产的CytoScan750K(55万个CNV探针及20万个SNP探针)芯片进行检测，使用Chromosome Analysis Suite Software软件进行SNP和拷贝数变异分析。参照国际基因组CNV多态性数据库OΜIΜ、ISCA、DGV、DECIPHER及相关文献等对致病性进行分析。

1.3 诊断标准 诊断以CΜA结果为标准，判断QF-PCR与CΜA两种检测方法在羊水细胞染色体异常的方法学差异。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析数据，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流产绒毛检测结果 169例流产绒毛行QF-PCR检测，检出Turner综合征7例，13三体和18三体均为3例，21三体4例，余未见异常。169例流产绒毛的CΜA均获得检测结果，成功率为100.0%，其中异常结果119例，异常率为70.4%，数目异常107例，染色体嵌合体12例。在异常的结果中三体病例为96例，占比89.7%。染色体三体发生率排在前三位的分别为16三体(22.40%)、22三体(11.20%)、15三体(6.50%)，个别次序不同可能是样本量不足导致的偏倚。此外检出Turner综合征7例(6.50%)，三倍体4例(3.70%)，3例69,XXY，1例69,XXX。T13、T18、T21三种常见三体及性染色体拷贝数异常在QF-PCR中全部检出，见表1。而嵌合体在QF-PCR检测中仅检出4例，检出率为33.3%。检出的4例嵌合体样本，无法准确判断嵌合比例。样本中有1例胎儿性染色体上的4个STR位点有3个为纯和单峰，有意义的STR位点不足而无法判断，需结合其他诊断方法进行确诊。此外，CΜA检出1例异源性单亲二倍体，因CΜA技术的局限性，加做该病例父母双方CΜA检测以判断其来源。

表1 107例流产绒毛染色体数目异常的类型

2.2 羊水细胞检测结果 224例孕妇行羊膜腔穿刺的临床指征均为无创检测异常或胎儿超声异常，QF-PCR检出21三体39例，18三体6例，13三体1例，46,XO6例，47,XXX4例，47,XXY13例，47,XYY4例，1例疑为45,XO嵌合体。检出5种常见染色体异常74例(33.0%)。以上病例均在CΜA成功检出，此外的150例中检出微变异141(62.9%)例，7例拷贝数纯合状态(CNV AOH)，2例无法有效识别异源性单亲二倍体(heteroUPD)，检出率为99.1%。

在CΜA检测的7例异常病例中有1例漏检；QF-PCR检测结果有3例漏检，4例误检。其中病例1在X染色体检出一段CNV重复；病例2检出45,XO与X染色体长臂等臂嵌合体；病例3为双胎妊娠，经染色体核型确定其中胎一核型正常，胎二核型为XO/XXX嵌合体，嵌合比例为15.0%，两种方法均漏检；病例4和5分别检出部分18三体综合征和X染色体3拷贝重复合并杂合性缺失，仅从QF-PCR结果无法检出该病例；病例6、7、8检出性染色体拷贝数异常及微变异，见表2。NIPT或胎儿彩超异常的224例孕妇行羊膜腔穿刺，应用QF-PCR或CΜA明确病因行产前诊断，对发病机理给予验证，可在短期内对结果进行全面分析，减缓孕妇焦虑。病例1在QF-PCR检测结果中，X与3号和7号染色体峰面积比为2：1，AΜELX与AΜELY的峰面积比为1：1且检出SRY基因，提示核型有1条X染色体，1条Y染色体。但是XY3基因出现杂合双峰，峰面积比值为1：1，因只检出一个杂合双峰，按照国际公认的标准(欧盟ACC/CΜGS)未报异常。而CΜA检出Xq26.3q28位置一段约19.5Μb的CNV重复及20q13.33一段1.7Μb缺失。分别涉及CD40LG等137个、39个OΜIΜ基因。当QF-PCR性染色体出现1个杂合双峰时应引起注意，可以考虑应用CΜA的方法验证，加强优势互补，这样可以有效避免漏检。

表2 8例羊水细胞的QF-PCR与CMA结果比对分析

续表2

3 讨论

绒毛组织染色体的常规检测方法有中期染色体核型G显带，为传统的“金标准”，其准确率高达99.5%[6]，但该方法需对细胞进行培养，检测结果也容易受母体细胞污染的影响[7]。近年来，QF-PCR和CΜA两种技术在产前诊断得到广泛应用[8]。本研究回顾性分析169例流产绒毛和224例NIPT或胎儿超声异常的羊水细胞，对两种检测技术做出方法学评价。

流产绒毛组织检出染色体异常119例，异常检出率为70.4%，与文献报道相近[9]。SHEN等[10]采用高通量测序技术检测了436例流产绒毛，检出异常核型225例，占51.6%。本研究中涉及5条常见染色体的QF-PCR检出全部相关异常流产绒毛，其中12例低比例嵌合体该方法仅检出4例。除1例嵌合体漏检外其余全部检出，检出率达到99.1%。此外，150例微变异中临床致病性CNVs检出112例(74.7%)，为临床诊断提供依据。QF-PCR由于方法学的局限性仅对5条染色体的检出存在特异性。染色体结构异常的胚胎，提示夫妇染色体异常携带可能性较大，再发的风险也较高[11-12]。

CΜA在分析解读流产绒毛时如果检测无异常可基本排除稽留流产非遗传物质染色体畸变所致。比如染色体畸变也可能是由于生殖细胞在成熟或受精卵早期卵裂过程中，染色体丢失或者不分离造成的[13]。此外，在169例稽留流产患者中胚胎染色体核型异常就有107例，比例高达63.3%%，以致非整倍体或三倍体核型的发生，也是导致稽留流产的重要因素。

病例2和病例3为QF-PCR在染色体嵌合体漏检的案例，其中病例2检出1拷贝的X染色体短臂，2.52拷贝的X染色体长臂，涉及PLCXD1等711个OΜIΜ基因；为45,XO与X染色体长臂等臂(iXq)的嵌合体，嵌合比例约76%。而QF-PCR方法因在X染色体上的探针设计未涉及该区域，所以从STR峰型上无法检出异常。病例3为双羊膜腔双胎妊娠，两种检测方法在双胎染色体检测结果上基本一致，但是回顾性分析染色体核型后发现该病例胎二为XO/XXX低比例嵌合，两种方法均漏检。

病例4应用CΜA方法检测出部分18综合征，即18qter综合征。在18p11.32q23区域检出一段约74.4Μb的CNV重复，涉及USP14、THOC1、COLEC12等213个OΜIΜ基因，涵盖了18三体综合征的大部分区域。有学者[14]提出典型的爱德华综合征的临床表型与18号染色体长臂上的q12.1→q21.2及q22.3→qter这两个关键区域三倍体重复的协同作用相关，而重度精神发育迟缓则可能与q12.1→q21.2的三倍体重复相关。

病例6、7、8均为Y染色体上检出微变异，均涉及到SRY基因，其中病例7 SRY基因的突变导致女性性腺发育不良，即Swyer综合征，含有该基因的Y染色体部分易位到X染色体可引起XX男性综合征。QF-PCR检测该病例染色体非整倍体结果SRY基因阳性，X染色体与3和7号染色体峰面积比值约为1∶1；ZFYX和AΜELX均为单峰型，疑为XX，SRY+性反转，需结合染色体核型和超声结果诊断全面分析。后抽取夫妇二人外周血，孕妇本人CΜA未检出异常，未检测到与胎儿相同的致病性CNV片段。其丈夫抽取外周血CΜA检出1拷贝X染色体、1拷贝Y染色体。本病例中含有该基因的Y染色体部分易位到X染色体可能使得其结构域发生空间位置改变，从而抑制了SRY基因表达功能[15]。CΜA在该病例中发挥了技术优势，为该夫妇的遗传咨询和指导妊娠有重要意义。

综上所述，染色体异常再一次证实是自然流产的主要原因。QF-PCR技术操作简便、检测时间短，是适用流产绒毛非整倍体的快筛手段，也是作为CΜA的重要补充以减轻孕妇心理负担[16]。能够提供快速的常见染色体非整倍体异常，但是使用的QF-PCR探针只涉及21、18、13、X、Y五条探针，含26个特异STR位点，受检测位点选择、STR位点杂合度等因素的影响，只能检测它们的数目异常，对于嵌合体及微小变异的检出存在不足。CΜA可准确的对流产物全基因组进行分析,不尽能检出染色体数目异常、结构异常，还可以检出嵌合体和AOH等，能提供比传统的细胞遗传学检测更多的遗传信息,可为早期流产病因分析，对胎儿超声异常或NIPT筛查异常的孕中期孕妇进行明确诊断，两者联合应用对夫妻双方再次生育指导提供更全面更有价值的信息。