通关藤的适宜采收期研究

韩 俊，沈雪梅，龙光强，余 珊，杨丕琼，张峪榕

（1.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；2.昆明市农业科学院，昆明 650034）

通关藤［Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn］为萝藦科牛奶藤属多年生攀援木质藤木植物，广泛分布于热带及亚热带地区的云南、广东、福建、台湾、贵州等地［1］。通关藤始载于《滇南本草》，其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清热解毒、止咳平喘、降压、保肝、抗癌等功效［2，3］。通关藤中含有机酸、多糖、生物碱、树脂、色素及甾体苷等多种化学成分，其中C21甾体类是其主要化学成分，被现代医学认为是具有抗肿瘤作用的主要活性物［4，5］。临床采用通关藤总苷片、通光素、通关藤苷元甲治疗慢性气管炎［5］。目前，通关藤在食管癌、宫颈癌、急性白血病等多种病症的治疗方面也具有独特优势［6，7］。

随着近年来对通关藤的开发利用，以通关藤为原料制成的消癌平口服液、注射液、颗粒剂、胶囊等中成药被广泛应用于临床，对胃癌、肝癌、肺癌、食管癌等各类恶性肿瘤疗效较显著［8-10］，同时科研人员对药用植物通关藤的关注度倍增。研究工作多集中在原植物考证、生物学特性、地理分布特点、野生资源及野外生境、无性繁殖、有性繁殖、抗性研究、化学成分分析及方法和临床药理学等方面，而从通关藤的产量和质量研究其最佳采收期的报道较少。

中药材的种类繁多，用药部位也有所不同，对应的最佳采收时间也不同，最佳采收时间是针对药材的质量和产量而言的。中药材质量的好坏，一方面是由本身所积累的产量所影响；另一方面取决于有效成分含量的高低。所以，中药材的最佳采收期应在产量和有效成分含量相对较高的时期。一般来说，植物没有生长成熟，产量较低，有效成分积累还没达到顶峰，自然用药效果也就不理想，若超过了中药材的成熟期，造成人力、物力和财力浪费的同时，有效成分含量也会逐渐降低，直接影响药物的临床疗效。因此，为了合理利用通关藤，寻找其最佳采收期就显得至关重要。

本试验研究不同生长期通关藤的茎粗和茎长，分析其产量的变化；测定不同生长期通关藤总皂苷的含量，通过产量和质量变化来确定通关藤的最佳采收时期，以期为通关藤的生产和临床合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

DZF-6050B真空干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）、家用小型粉碎机、梅特勒-托利多万分之一电子天平、超声波仪器（FS-550T，功率550 W，频率50 Hz）、CARY 60 UV-Vis紫外分光光度计［安捷伦科技（中国）有限公司］、HH-S型恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限公司）、电子数显卡尺等。

1.2 材料与试剂

试验所用对照品通关藤苷G［11，12］购于云南云科生物技术有限公司（编号PR1371，纯度大于98%）；不同生长期的通关藤试验材料由云南信通植物药业有限公司通关藤规范化种植（GAP）良种繁育与示范基地提供，从基地取不同生长期（一年生、一年半生、两年生、两年半生、三年生、三年半生、四年生）通关藤的茎烘干粉碎备用。冰乙酸、香草醛、浓硫酸、97.5%乙醇、浓度5%香草醛-冰醋酸溶液均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 通关藤总皂苷含量测定

1）对照品溶液的制备。取通关藤苷G 1 mg，置于10 mL锥形瓶中，精密加入4.25 mL乙醇使其完全溶解，制成浓度为0.24 mg/mL的对照品溶液。

2）最佳供试品溶液提取方法的确定。采用4个因子，每个因子3个水平，共9个处理的正交试验设计L（934）。以四年生通关藤为试验材料，采用超声波提取方法，提取时间为30、40、50 min 3个水平；提取温度为40、50、60℃3个水平；提取溶剂乙醇体积分数为60%、70%、80%3个水平；料液比为1∶20、1∶30、1∶40（mg∶mL，下同）3个水平，探究超声提取时间、提取温度、乙醇体积分数、料液比对通关藤总皂苷提取的影响。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取通关藤粉末0.2 g，置于10 mL具塞试管中，精密加入60%乙醇4 mL，超声提取时间50 min，提取温度60℃，超声结束后取出静置15 min，取上清液备用。

1.3.3 空白对照溶液的制备 不加通关藤药材，按照“1.3.2”的方法制备空白对照溶液。

1.3.4 样品的测定 精密量取供试品上清液各0.5 mL，分别置于10 mL具塞试管中，于60℃水浴上挥干甲醇，加入香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和浓硫酸溶液0.6 mL，摇匀，70℃水浴加热15 min，取出后立即用流水冷却，加入10 mL冰醋酸稀释。以不加样品溶液为空白。采用紫外-可见分光光度法在462 nm处测定吸光度，同法测定对照样品的吸光度，计算含量即得。

1.3.5 标准曲线的制定 精密吸取制备的通关藤苷G对照品溶液（浓度0.24 mg/mL）0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL置于10 mL具塞试管中，按照“1.3.4”的方法进行操作，在波长为462 nm处测定吸光度，以3次测定吸光度的平均值作为纵坐标，以对照品含量为横坐标，绘制标准曲线（X为对照样品含量，Y为吸光度）。回归方程为Y=1.609 5X+0.024 9，r=0.999 4，呈良好的线性关系。

1.3.6 精密度试验 按“1.3.2”的方法制备5份供试品溶液，并按照“1.3.4”的方法进行操作。结果显示，RSD为1.37%，小于2.00%，精密度符合规定。

1.3.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“1.3.4”的方法进行操作，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，在462 nm下测定吸光度，RSD为1.69%，说明供试品溶液显色后在3.0 h内待测定组分化学性质稳定。

1.3.8 回收率试验 精密称取0.1g已知含量的云南产通关藤药材6份，分别加入对照样品，按样品含量的1/2加入，按“1.3.4”的方法制备供试品溶液，测定吸光度，并计算回收率。结果平均回收率为99.63%，RSD为1.46%。

1.3.9 样品总皂苷含量的测定 精密称取半年生、一年生、一年半生、两年生、两年半生、三年生、三年半生、四年生的8个生长期药材各0.2 g，按“1.3.2”和“1.3.4”的方法进行操作，在462 nm处测定样品吸光度，同法测定对照品吸光度。再利用回归方程将吸光度代入，计算出通关藤总皂苷含量。

1.4 数据分析

采用SPSS19.0统计软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 提取条件对通关藤总皂苷提取率的影响

经LSR差异显著性检验表明（表1），处理3通关藤总皂苷提取率最高，达到6.412 6%，与处理4、5差异达显著水平，与处理1、2、6、8、9差异达极显著水平。表明采用超声波提取通关藤总皂苷溶液的最佳提取条件是提取溶剂乙醇体积分数为60%，料液比为1∶40，提取时间为50 min，提取温度为60℃。

表1 提取条件对通关藤总皂苷提取率的影响（n=9）

2.2 通关藤总皂苷含量的测定

由表2可以看出，两年生通关藤总皂苷含量为7.400 2%，与其他生长期总皂苷含量存在极显著差异：两年半生通关藤总皂苷含量为7.160 2%，与三年半生、四年生通关藤总皂苷含量也存在极显著差异，最低的为半年生通关藤茎中总皂苷含量。通关藤总皂苷含量在两年生至两年半生时期相对较高、较稳定，之后缓慢下降。不同生长期通关藤总皂苷含量大小顺序为两年生＞两年半生＞三年生＞三年半生＞四年生＞一年半生＞一年生＞半年生。

表2 通关藤总皂苷含量测定结果

2.3 不同生长期通关藤茎长和茎粗的测定

通关藤药用部分是藤茎，呈扁柱圆形，略扭曲。茎类药材的产量主要取决于茎粗和茎长，茎越长越粗，茎的质量就越大，产量就越高，因此茎类药材产量与其茎长和茎粗呈正相关。测定材料通关藤种植时间在2016年5月，种植土地呈48°，向阳坡。种植行间距为2.0 m×0.5 m，田间水肥管理相同。以8个不同生长期通关藤作为调查对象，田间试验抽样采用五点式抽样法，对抽中的植株进行挂牌，每年的11月和5月分别测定2次，测量茎长和茎粗。

结果（表3）表明，通关藤的茎长生长到三年时较之前的茎长差异达极显著水平，之后增长缓慢。通关藤的茎粗生长到三年半以后较之前的茎粗差异达极显著水平，以后也是缓慢增粗。因此，从通关藤的茎长和茎粗来看，到三年时进行采收，产量最大。

表3 不同生长期通关藤的茎长和茎粗

3 小结与讨论

3.1 通关藤总皂苷含量测定

以正交试验设计，采用超声波法提取通关藤总皂苷，试验数据通过统计分析，确定最佳的提取条件。当乙醇体积分数相对较低（60%）时，只要相对增加提取的温度（60℃）和时间（50 min），就能增加总皂苷的提取率（6.412 6%）；或者适当增加乙醇的体积分数（80%），即使降低提取温度（40℃），也可以保持较高的提取率（6.266 2%），能在较短时间和较低温度下提取率比传统的回流提取工艺明显提高［13］。分析其原因，可能是因为超声波能促使植物细胞组织产生破壁或变形，使中药材有效成分充分溶解出来。

中药材的种类繁多，用药部位也有所不同，对应的最佳采收时间也不同。采收的时间是否恰当，会直接影响其临床疗效。最佳的采收时间是针对药材的质量和产量而言的。中药材质量的好坏，一方面是由本身所积累的产量所决定；另一方面取决于有效成分含量的高低。所以，中药材的最佳采收期应在产量和有效期含量相对较高的时期。总皂苷属于次生代谢产物，植物需要生长一定的时间进行积累［14］，试验结果显示通关藤总皂苷在两年生时含量达到最高，之后缓慢下降。

试验结果表明，8个不同生长期通关藤总皂苷含量随着植株不断的生长，呈先增后减的趋势，存在极显著差异。通关藤整个生长期中总皂苷含量在两年以前含量增加很快，从半年生总皂苷含量的3.268 9%到两年生达到最高，含量为7.400 2%，在两年生到两年半生（总皂苷含量为7.160 2%）之间维持一个较高的水平，之后逐渐缓慢下降。

3.2 通关藤的产量

对于不同生长期通关藤的茎长和茎粗的测定，采取顺序抽样法中的五点式抽样方法，此方法操作简单，能使抽样单位在试验小区中均匀分布，样本具有代表性，一般情况下这种抽样方法存在的误差较小。但若存在趋势变异，可能出现偏差，而且难以无偏估计抽样误差。所以要在抽样样本个体性状表现一致时，再采用顺序抽样法进行抽样。

不同生长期通关藤的茎粗和茎长随年份的增长而增加，通关藤药用部分是藤茎，茎长和茎粗决定着产量的高低。通关藤的茎长从三年生、三年半生、四年生都与之前存在极显著差异，以后缓慢生长；通关藤的茎粗生长到三年半就达到极显著差异，以后也是缓慢增粗。因此，从通关藤的茎长和茎粗来看，通关藤生长到三年时继续种植，虽然生物产量会有所增大，但增加不显著，所以通关藤生长到三年时进行采收，可以节约大量的人力、物力和财力。

3.3 小结

根据本试验结果分析得出，通关藤的产量到三年生时增长明显，产量也相对较高。而通关藤总皂苷含量最高的为两年生，之后逐渐缓慢下降。所以考虑到兼顾通关藤的产量与总皂苷含量都达到相对较高水平，确定最佳采收时间为两年生至三年生的通关藤茎，该结论可为通关藤临床用药提供理论依据。