土荆芥白粉病菌的分子检测与鉴定①

范会云 黄 勇 陈卫明 黄意成 曾庆钱

（广东省中药研究所 广东广州 510000）

土荆芥（Chenopodium ambrosioidesL.）为藜科藜属芳香性草本植物，原产于中美洲、南美和墨西哥南部，全草入药。2003 年，土荆芥被列为中国首批外来入侵物种之一［1］。目前，仅韩国对土荆芥白粉病有相关报道，认为引起韩国境内土荆芥白粉病的病原菌为Erysiphe betae［2］，中国尚未有相关报道。土荆芥被白粉菌侵染后，初期叶片出现白色粉状斑点，粉状斑点不断扩大或相连成片，后期叶面布满白色粉层，叶片变黄、变褐。

在传统的病原菌鉴定方法中，白粉菌主要以形态学为主要鉴定指标，但这种分类存在严重不足，如缺少无性世代的特征、许多子实体类型经常难以获得等［3-4］。近年来，植物病原菌在r-DNA的内转录间隔区（ITS）被广泛的应用于快速检测和鉴定植物病原菌［5-6］。目前国内尚未见土荆芥白粉病病原菌分子分类系统的相关研究报道，本文利用分子生物学技术对其分类特征及亲缘关系进行研究，以确定土荆芥白粉病菌的种类。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白粉菌样本于2020 年5 月20 日采自广东省博罗县醪酥村农场，寄主植物为土荆芥，样品编号为MT 799 966。提取白粉菌基因组DNA 所使用的的试剂盒购自OMEGA bio-tek 公司（货号：D3390）.

1.2 实验方法

1.2.1 白粉菌样本的收集、基因组DNA 的提取和特异序列的扩增

用细毛刷轻轻地将叶片表面的菌丝与孢子混合物刷到培养皿中，转入到2 mL 离心管中，按照试剂盒说明书中的步骤提取土荆芥白粉病菌基因组DNA，并保存于-20 ℃备用。PCR反应的引物采用通用引物 ITS1 和 PM6［7-8］，PCR 反应所用的试剂是Green Taq Mix （Vazyme：P131-03）。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定与分析。

1.2.2 ITS序列分析

将测序所得ITS 序列在GenBank 数据库中Blast 比对分析，从NCBI 数据库中下载25 种白粉菌ITS 保守序列（表1），利用软件MEGA7将测序所得白粉菌序列与数据库中ITS 序列比对，并构建系统发育树，推演系统进化关系。

表1 用于同源性比较分析的白粉菌

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取与PCR扩增结果

利用通用引物ITS1 和PM6 进行PCR 扩增获得的目的片段以及基因组DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，并送测序，测序获得长度为535 bp 的碱基序列。

2.2 构建土荆芥白粉病菌ITS 序列进化树的结果与分析

根据比对结果，土荆芥白粉菌MT799966 的ITS 序列与KY399969.1 的ITS 序列最为接近，相似度达到99%以上。说明样品土荆芥白粉菌与KY399969.1 具有较近的亲缘关系。此外，25 种白粉菌的ITS 序列在265～434 bp 保留着较高遗传一致性，可能是这个片段起到了保障白粉菌性状稳定遗传作用。

对25 种不同的白粉菌ITS 序列用MEGA7 软件构建系统发育树并进行分析（图1）。结果表明，25 种白粉菌的ITS 序列形成2 个比较大的分支，本研究中的样本MT799966 的ITS 序列与希腊的红菾菜白粉菌（KY399969.1）和英国的甜菜白粉菌（DQ164440.1）的ITS 序列的距离最近，也就是说本研究中的土荆芥白粉菌与它们的亲缘关系较近，从分子水平上证明，发生在广东醪酥村的土荆芥白粉病是由E.betae引起。

图1 25种白粉菌系统进化树

3 讨论

在传统的分类方法中，白粉菌的分类主要依据寄主植物的种类、危害症状以及病原菌的显微特征进行分类，不仅耗时耗力，而且还会受到研究人员的经验和主观因素的影响，得出错误的结论［7］。

以ITS序列作为一种遗传分子标记的PCR技术是诊断植物病害的快速、有效的方法。由于真菌ITS 序列具有种内保守性强、种间存在变异的特点，使得ITS已经成为研究真菌系统发育和检测的重要的手段［9］。马原松等通过对河南省5 种植物（大叶黄杨、凤仙、豇豆、菊芋和番茄）白粉菌的ITS 序列进行分析，认为ITS 序列可用来作为病原菌分类鉴定和系统发育等研究的依据。

通过利用特异性引物ITS1/PM6 进行PCR 扩增，获得本地土荆芥白粉菌的ITS序列，将获得的序列在NCBI 中进行比对，从中筛选相似度较高的白粉菌种类的ITS序列，建立系统发育进化树，发现引起土荆芥白粉菌的种类属于Erysiphe属，本研究结果将为该病原菌的检测、分类与鉴定提供理论依据，同时，也可为防范土荆芥白粉菌的其他寄主植物白粉病的防控提供理论指导。