黄柏不同炮制方法对溃疡性结肠炎小鼠药效的影响

赵洪超 关书博 王丹

摘要 目的：探究不同炮制方法對黄柏药效的影响。方法：选择Balb/c小鼠为实验动物，将其随机分为蜜制组、盐制组、酒制组、生品组与模型组，每组10只，建立溃疡性结肠炎模型，蜜制组、盐制组、酒制组、生品组给予对应药液灌胃干预，比较各组疾病活动指数（DAI）、结肠长度、结肠大体形态损伤指数、组织学评分及结肠组织炎症介质[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）]、氧化应激指标[超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）]差异。结果：其中蜜制组、酒制组DAI及组织学评分均明显低于盐制组、生品组，结肠组织TNF-α、IL-17水平均明显低于盐制组、生品组，结肠组织IL-10水平均明显高于盐制组、生品组，差异有统计学意义（P<0.05）;蜜制组、盐制组、酒制组结肠长度及结肠组织SOD、GSH-Px水平均明显高于生品组，结肠大体形态损伤指数及结肠组织MDA水平均明显低于生品组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：不同方法炮制黄柏均可增强对溃疡性结肠炎的药效，尤以蜜制、酒制黄柏增强效果较为突出，可为其炮制工艺提供参考。

关键词 黄柏;炮制;药效;溃疡性结肠炎;小鼠;疾病活动指数;结肠长度;结肠大体形态损伤指数;组织学评分;炎症介质;氧化应激指标

Effects of Different Processing Methods on Ulcerative Colitis Mice Pharmaceutical Effects of Cortex Phellodendri

ZHAO Hongchao，GUAN Shubo，WANG Dan

（The Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110101，China）

Abstract Objective：To explore the effects of different processing methods on pharmaceutical effects of Cortex Phellodendri.Methods：Balb/c mice were selected as experimental animals.And were randomly divided into a ulcerative colitis group，a honey processing group，a salt processing group，a wine processing group，a crude herb group respectively，with 10 mice in each group.The disease activity index （DAI），colon length，colon gross morphological damage index，histological score and colonic cytokines [tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-10 （IL-10），interleukin-17 （IL-17）] and oxidative stress indicators [superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA），glutathione peroxidase （GSH-px）] were compared between the 2 groups.Results：The DAI and histological score in honey processing group and wine processing group were significantly lower than those in salt processing group and crude herb group.The levels of TNF-α and IL-17 in colon tissues were significantly lower than those in salt processing group and crude herb group while the level of IL-10 in colon tissues was significantly higher than that in salt processing group and crude herb group （P<0.05）.The colon length and levels of SOD and GSH-px in colon tissues in honey processing group，salt processing group and wine processing group were significantly higher than those in crude herb group，and the colon gross morphological damage index and the MDA level in colon tissues were significantly lower than those in crude herb group （P<0.05）.Conclusion：Different processing methods of Cortex Phellodendri can enhance the pharmaceutical effects of ulcerative colitis，especially the honey-processing and wine-processing Cortex Phellodendri have more prominent enhancement effect，which can provide reference for processing technology.

Keywords Cortex phellodendri; Processing; Pharmaceutical effects; Ulcerative colitis; Mice; Disease activity index; Colon length; Colon gross morphological damage index; Histological score; Cytokines; Oxidative stress indicators

中图分类号：R282;R574文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.015

黄柏是芸香科植物黄皮树的干燥树皮，常言道“檗木，黄檗也，今处处有之，以蜀中者为佳”，该药材性寒味苦，归肾、膀胱经，有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮之功效，主治以湿热泻痢、热淋涩痛、疮疡肿毒、热淋涩痛等疾病为代表的热证[1]。传统的黄柏炮制方法较多，《证治准绳》记载“生用降实火，熟用酒制治上，盐制治下，蜜制治中不伤胃”[2]，可见古代医家对黄柏炮制及辨证用药的经验总结已较为全面，但未能从药代动力学、药效学的角度获得解释。目前黄柏复方或组方治疗溃疡性结肠炎的效果已获得广泛证实[3-7]，但黄柏具体如何影响治疗效果仍不十分明确。本研究旨在分析不同黄柏炮制药品治疗溃疡性结肠炎的疗效差异，取得一定成果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物材料 选择Balb/c小鼠为实验动物，均为雄性，周龄为6～8周，体质量为18～25 g，随机分为蜜制组、盐制组、酒制组、生品组与模型组，每组10只，开展为期1周的适应性喂养，确保小鼠自由饮水、摄食，光照周期为12 h光照+12 h黑暗，室温维持在20～25 ℃。

1.1.2 药品材料 川黄柏原药材洗净后切4 mm丝，取适量置于容器中，蜜制黄柏100 g黄柏丝配30 g蜂蜜+30 g蒸馏水拌匀，闷润2 h，取出后在120～130 ℃锅内炒制4 min，放凉即得;盐制黄柏100 g黄柏丝配2 g食盐+30 g蒸馏水，闷润2 h，取出后在150～160 ℃锅内炒制6 min，放凉即得;酒制黄柏100 g黄柏丝配20 g黄酒+30 g蒸馏水，闷润2 h，取出后在150～160 ℃锅内炒制6 min，放凉即得;生品直接以蒸馏水润透后干燥即得。分别取适量炮制成品，100 g成品加入1 L蒸馏水浸泡30 min，而后以文火煎煮60 min，趁热过滤保留药液，药渣回锅加入0.8 L蒸馏水，文火煎煮60 min，趁热过滤，合并2次药液，浓缩收汁至200 mL备用。

1.2 方法

1.2.1 造模及给药方法 小鼠饮用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）灭菌水，以0.5%羧甲基纤维素钠灭菌水灌胃，持续≥5 d，以疾病活动指数（DAI）达到2分作为造模成功标准，随后蜜制组、盐制组、酒制组及生品组小鼠给予相应药液灌胃干预，剂量按体质量0.01 mL/g给药，在此期间各组均饮用不含DSS的灭菌水。

1.2.2 评估方法 试验完毕后采用DAI评估小鼠病情严重程度[8]，分别从体质量下降、大便性状、便血程度3个方面作出评价，每个方面根据严重程度计为0～4分，总分/3为最终得分，分数越高表示病情越严重。处死小鼠并解剖采集完整结肠，测量其长度，以如下标准评估大体损伤表现[9]，0分：无损伤。1分：黏膜略微充血。2分：存在溃疡且累及<25%受损面积。3分：存在溃疡且累及25%～50%受损面积。4分：存在溃疡且累及>50%受损面积。将小鼠结肠组织常规固定、脱水、透明化、包埋、切片、染色后进行光镜下组织学观察，并根据相关文献提出的评估方法对其组织学状态作出评价[10]，观察上皮损伤及溃疡形成、溃疡深度、淋巴细胞募集程度、炎性细胞浸润深度、中性粒细胞浸润深度、嗜酸性粒细胞浸润深度及水肿程度7个方面进行评价，每个方面根据病变程度计为0～3分，分數越高表示病变越严重。

1.2.3 指标检测方法 准确切取小鼠结肠相同部位组织100 mg，加入4 ℃磷酸盐缓冲液（PBS），组织研磨机匀浆30 s，并在8 000×g加速度下离心10 min，提取上清，分别采用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）对应酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：s160539、s171157、s161204、s180427、s171013、s170635），严格按照说明书操作，测定上述指标在上清液中的浓度水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据资料处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间整体比较采用单因素方差分析，对整体比较有统计学意义的指标，实施Student-Newman-Keuls q检验进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAI与结肠长度比较 各组小鼠DAI与结肠长度比较差异有统计学意义（P<0.05）;其中蜜制组、酒制组DAI均明显低于盐制组、生品组，且上述4组均明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;蜜制组、盐制组、酒制组结肠长度均明显大于生品组，且上述4组均明显大于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 结肠大体形态损伤指数、组织学评分比较 各组小鼠结肠大体形态损伤指数、组织学评分比较差异有统计学意义（P<0.05）;其中蜜制组、盐制组、酒制组结肠大体形态损伤指数均明显低于生品组，且上述4组均明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;蜜制组、酒制组组织学评分均明显低于盐制组、生品组，且上述4组均明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 结肠组织炎症介质比较 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-10、IL-17水平比较差异有统计学意义（P<0.05）;其中蜜制组、酒制组结肠组织TNF-α、IL-17水平均明显低于盐制组、生品组，且上述4组均明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;其中蜜制组、酒制组结肠组织IL-10水平均明显高于盐制组、生品组，且上述4组均明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 结肠组织氧化应激指标比较 各组小鼠结肠组织SOD、MDA、GSH-Px水平比较差异有统计学意义（P<0.05）;其中蜜制组、盐制组、酒制组结肠组织SOD、GSH-Px水平均明显高于生品组，且上述4组均明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;蜜制组、盐制组、酒制组结肠组织MDA水平均明显低于生品组，且上述4组均明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

溃疡性结肠炎多由过食寒凉、嗜食辛辣、暴饮暴食等饮食不节行为引起脾脏失于运化所致[11]，气血生化乏源而湿浊内生热化，肠胃怫郁，湿胜濡泻，气血与湿热搏结，化为脓血黏液，气液宣通不能，故湿热蕴阻肠腑而为病。黄柏治疗溃疡性结肠炎能控制急性发作，缓解临床症状，并减少复发[12]，其复方水煎剂保留灌肠效果尤其确切，可起清热健脾、化湿止痢之效，但需严格把控用药剂量、药液浓度与温度[13]。本研究结果显示，蜜制组、盐制组、酒制组、生品组小鼠DAI及结肠大体形态损伤指数、组织学评分均比模型组更低，结肠长度则比模型组更高，这表明黄柏炮制成品及生品治疗小鼠溃疡性结肠炎效果均属良好。其中蜜制、酒制黄柏疗效较为突出，盐制黄柏与生品黄柏次之，究其原因可能与不同炮制方法可改變黄柏内有效化学成分保留情况，以及用药后在小鼠体内分布、吸收、代谢、廓清等产生较大影响有关。

生黄柏具有苦寒之性，清热燥湿作用强，药性猛烈而易使气血下沉，泻火效果极佳;蜂蜜常用于调补脾胃、扶正养阴，蜜制法可保护胃腑不受黄柏寒性所伤，可治疗中焦热病[14];黄酒作为常用药引，乙醇含量适中且性质温和，充分溶解药材的有效疏水性成分，提高药物效能，并令药性上体，酒制黄柏常用于治疗上焦热病[15];而《药品辨义》有云“用咸水炒，使咸入肾，主降阴火，救肾水”，可见盐制黄柏使其苦寒之性进一步增强，又引药下行入肾，增强滋阴降火之功，可主治下焦热病[16]。现代药理研究显示，黄柏有效成分包括小檗碱、小檗红碱、黄柏碱、柠檬苦素、黄柏酮及木兰花碱[17-19]，其中尤以小檗碱对肠道组织作用最为明显，可促进溃疡愈合、保护黏膜屏障、抑制炎症反应、维持菌群平衡并增强肠管张力与蠕动幅度[20]。本研究发现，蜜制组与酒制组小鼠结肠组织TNF-α、IL-17水平明显低于盐制组与生品组，而IL-10水平则明显高于盐制组与生品组，提示蜜制或酒制黄柏相较于盐制黄柏或生品黄柏能对溃疡性结肠炎小鼠产生更为强效的炎症反应抑制作用。相关专家提出，双酯类生物碱及醇胺类生物碱在体内转化效率相对单酯类生物碱更慢，混入蜂蜜后，肝脏代谢易于达到饱和，生物碱在通过门静脉进入肝脏时速度减缓，生物碱可在循环系统中停留更长时间，有助于产生持久药效[21]。本研究还发现，蜜制组、盐制组、酒制组的结肠组织SOD、GSH-Px水平显著较生品组更高，而结肠组织MDA水平则显著较生存组更低，这说明炮制可增强黄柏抗氧化应激作用。但不同炮制方法增强效果差异不大，初步分析认为，酒制黄柏尽管提高小檗红碱在局部组织的分布，但由于肝肠循环的存在，可导致盐制黄柏小檗红碱药时曲线呈现双峰现象，因此二者综合作用下，并不对DSS诱发的溃疡性结肠炎局部氧化反应失衡的黄柏药液灌胃治疗效果增强产生影响。

综上所述，蜜制、盐制、酒制黄柏与生品黄柏均能有效恢复溃疡性结肠炎小鼠结肠长度，并逆转结肠大体损伤，抑制局部氧化应激反应，其中蜜制、酒制黄柏改善小鼠症状表现、病变程度及炎症介质表达效果较为理想，炮制药材与临床用药可以此为据开展相关工作。

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（2019-07-31收稿 責任编辑：杨觉雄）