麻黄连翘赤小豆汤对特应性皮炎小鼠皮肤组织PAR-2、TRPA1表达的影响

李彩艳 张玉鑫 袁慧敏 孙开元 汤阳 张淑静 高誉珊 孙燕 郑丰杰 李宇航

摘要 目的：探討麻黄连翘赤小豆汤对特应性皮炎（AD）小鼠皮损修复及PAR-2、TRPA1的表达的影响。方法：选用SPF级雄性BALB/c小鼠48只，随机分为正常组、模型组、激素组、中药组。除正常组外，各组用2，4二硝基氟苯（DNFB）诱导AD模型。造模后模型组给予皮炎平外抹，中药组给予麻黄连翘赤小豆汤灌胃，其余均给予等量蒸馏水灌胃，2次/d，共7 d。于第1、15、31、37天观察小鼠一般状态及搔抓行为并统计，HE染色观察致敏区域的皮肤病理变化，qRT-PCR、免疫组化分别检测皮肤中PAR-2、TRPA1的基因与蛋白表达。结果：与正常组比较，模型组小鼠搔抓频次显著增多，致敏皮肤处有明显红斑渗出，局部潮红，皮肤增厚，伴有结痂。中药组、激素组较模型组明显改善。病理显示模型组较正常组棘层明显增厚，角化珠增多，毛囊结构明显增多，角化层明显增厚，见炎性细胞浸润，表皮不平整;激素组、中药组角化层及棘层增厚，角化珠及毛囊结构略有增多，较模型组改善明显。模型组小鼠皮肤组织中PAR-2、TRPA1的mRNA的表达较正常小鼠均显著性上调（P<0.05），经过中药、激素干预后，其表达均下调显著（P<0.01）。与正常组比较，模型组皮肤组织PAR-2、TRPA1免疫反应阳性均明显增多，角质形成细胞处最为显著;中药组、模型组表达较模型组均有所降低。结论：麻黄连翘赤小豆汤改善AD皮损、减轻皮肤瘙痒，下调PAR-2、TRPA1的表达，进而调控非组胺依赖性神经信号传导有关。

关键词 特应性皮炎;非组胺依赖性瘙痒;麻黄连翘赤小豆汤;蛋白酶活化受体

Effect of Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction on the Expression of PAR-2 and TRPA1 in Sensitized Tissues of Atopic Dermatitis Mice

LI Caiyan，ZHANG Yuxin，YUAN Huimin，SUN Kaiyuan，TANG Yang，ZHANG Shujing，GAO Yushan，SUN Yan，ZHENG Fengjie，LI Yuhang

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction on skin repair and expression of PAR-2 and TRPA1 in mice with atopic dermatitis（AD）.Methods：A total of 48 SPF male BALB/c mice were randomly divided into a normal group，a model group，a hormone group and a traditional Chinese medicine group.Except for the normal group，AD models were induced by 2，4 dinitrofluorobenzene（DNFB）.After modeling，the model group was given Piyanping external application，the traditional Chinese medicine group was given Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction for intragastric administration，and the rest were given the same amount of distilled water intragastric administration，twice a day with a total of 7 days.On the 1st，15th，31st and 37th day，the general state and scratching behavior of mice were observed，and the pathological changes of sensitized areas were observed by HE staining.The gene and protein expressions of PAR-2 and TRPA1 in skin were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry respectively.Results：Compared with the normal group，the scratching frequency of the model group mice increased significantly，and the sensitized skin had obvious erythema exudation，local flushing，skin thickening and scab formation.Compared with the model group，the traditional Chinese medicine group and the hormone group improved significantly.Pathological examination showed that the spinous layer of the model group was significantly thicker than that of the normal group，keratinized beads were increased，hair follicle structure was significantly increased，keratinized layer was significantly thicker，inflammatory cell infiltration and epidermal irregularity were observed.Keratinized layer and spinous layer were thicker in the hormone group and the traditional Chinese medicine group，and keratinized beads and hair follicle structure were slightly increased，which was significantly improved compared with the model group.The expression of PAR-2 and TRPA1 in skin tissue of the model group was significantly higher than that of the normal group（P<0.05）.After intervention with Chinese medicines and hormones，the expression of PAR-2 and TRPA1 was significantly decreased（P<0.01）.Compared with the normal group，PAR-2 and TRPA1 immunoreactivity in the skin tissue of the model group increased significantly，especially in keratinocytes.The expression of PAR-2 and TRPA1 in the traditional Chinese medicine group and the model group was lower than that in the model group.Conclusion：Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction can improve AD skin lesion，relieve skin itching，down-regulate the expression of PAR-2 and TRPA1，and then regulate non-histamine dependent nerve signal transduction.

Keywords Atopic dermatitis; Non-histamine-dependent pruritus; Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction; Protease activated receptor

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.011

特应性皮炎（Atopic Dermatitis，AD），又称异位性皮炎、特应性湿疹，是由遗传因素和环境因素交互作用引起的慢性、复发性、炎症性皮肤病，主要临床表现为剧烈瘙痒、湿疹样皮损和皮肤干燥等，并伴有鼻炎或哮喘等过敏性疾病病史[1-2]。近年来，AD发病人群逐年升高，有效治疗的缺乏、强烈的瘙痒和皮疹等严重影响生命质量[3]。AD相关瘙痒是多种因素相互作用的结果，其确切机制尚不清楚。研究表明，非组胺依赖性瘙痒神经信号传导与瞬间电压感受体1（Transient Receptor Potential Ankyrin 1，TRPA1）通道偶联通路密切相关，而蛋白酶活化受体2（Protease Activated Receptor，PAR-2）作为非组胺依赖型致敏机制信号传导通路的关键分子，在AD瘙痒发生过程中起关键作用[4]。

麻黄连翘赤小豆汤为表里双解之剂，外可解表邪郁遏，内能清湿热蕴结，开鬼门、洁净府兼而有之，被广泛用于AD、湿疹、荨麻疹、痤疮、环形红斑等皮肤瘙痒症的辨证治疗[5]，疗效确切。对于其效应机制，马世忠等[6]曾观察其对组胺诱导豚鼠皮肤局部瘙痒、右旋糖酐诱导小鼠全身瘙痒模型的影响，但非组胺依赖性瘙痒相关机制尚未见报道。本实验通过观察麻黄连翘赤小豆汤对半抗原反复刺激诱导AD小鼠模型皮损的影响，并从PAR-2、TRPA1的表达来探讨其非组胺依赖性抗瘙痒机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6周龄，SPF级BALB/c小鼠，体质量（20±2）g、雄性，48只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2006-0006，饲养于北京中医药大学动物房。动物房温度（24±1）℃，湿度（45±10）%，由国家标准固体混合饲料喂养，自由摄食和饮水，实行12 h昼夜规律调整。

1.1.2 药物 《伤寒论》麻黄连翘赤小豆汤由“麻黄二两、连翘二两、赤小豆一升、生梓白皮一升、苦杏仁四十枚、生姜二两、大枣十二枚、炙甘草二两”组成。本课题组前期经考证实测，得出其现今临床参考剂量为麻黄6 g、连翘6 g、苦杏仁3 g、赤小豆34 g、大枣7 g、生梓白皮11 g、生姜6 g、炙甘草6 g[7]，方中连翘（即连翘根）、生梓白皮，现今药店不备，临床多分别用连翘、桑白皮代之[8-9]，中药材全部购置于北京同仁堂药店。浸泡、常规水煎2次，80 ℃水浴浓缩至1 g/mL（含生药），4 ℃冰箱储存备用。

1.1.3 试剂与仪器 2，4-二硝基氟苯（DNFB）（Sigma公司，美国，批号：M24218031），丙酮（国产分析纯，北京化工厂，批号：20170209），以丙酮为溶剂配置DNFB致敏溶液，皮炎平[华润三九（南昌）药业有限公司，国药准字H20080010]，苏木素染色液（中杉金桥，货号：ZLI-9610），伊红染色液（中杉金桥，货号：ZLI-9613），中性树胶（索莱宝科技有限公司，货号：G8590），PAR-2抗体（Abcam，英国，货号：ab180953），TRPA1抗体（Abcam，英国，货号：ab62053）;免疫组化检测试剂盒（中杉金桥，货号：SP-9001），DAB显色试剂盒（中杉金桥，货号：ZLI-9019）。Trizol、反转录cDNA试剂盒（Thermo Scientific公司，美国，货号：K1622），Power sybr green（ABI公司，美国，货号：4367659）。石蜡包埋机（Leica Biosystems，德国，型号：HistoCoreArcadia），石蜡切片机（Leica Biosystems，德国，型号：RM2245），摄像头（奥速，型号：V80），紫外分光光度计（IMPLEN公司，德国，型号：NanoPhotometer），定量PCR检测仪（ABI公司，美国，型号：272005354）;正倒置一体荧光显微镜（Echo公司，美国，型号：Revolve FL）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 适应性喂养7 d后，将小鼠随机分为空白对照组（正常组）、AD模型组（模型组）、麻黄连翘赤小豆汤组（中药组）、皮炎平观察组（激素组），每组12只。采用2，4二硝基氟苯（DNFB）半抗原反复刺激的方法制备小鼠AD模型[10]。具体如下：DNFB致敏前1 d，用电推剪和脱毛霜剃去小鼠背部毛发，面积约2.0 cm×3.0 cm。在2 cm×2 cm的纱布上滴涂1%的DNFB溶液（橄榄油/丙酮1∶3混合制成基质溶液，配制1%的DNFB致敏溶液）200 μL，然后均匀涂抹在小鼠背部皮肤，2次/周（即造模开始第1、4、8、11天）。2周后，改用0.2%的DNFB溶液致敏刺激，2次/周重复上述操作，持续3周（即第15、18、21、25、28、32、35天），DNFB半抗原致敏刺激共持续5周（模型制备操作流程如图1所示）。对照组小鼠采用丙酮溶液涂抹小鼠皮肤，时间频率和模型组相同。

1.2.2 给药方法 中药组于第31天灌服麻黄连翘赤小豆汤;正常组、模型组、激素组灌服等量温开水;激素组外用皮炎平涂抹。2次/d，连续7 d。按人鼠剂量换算公式计算出小鼠用量为11.86 g/kg[11]。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 小鼠搔抓行为观察 实验过程中，按照Kuraishi方法[12]，分別于第1、15、31、37天，用摄像机记录并观察小鼠搔抓行为，观察小鼠前后肢对头面部、背部、腹部的搔抓行为，统计各组小鼠30 min内的搔抓次数。

1.2.3.2 小鼠背部皮损改变情况 肉眼观察各组小鼠背部皮损程度，包括出血、水肿、表皮脱落和鳞屑（干燥）情况，并拍照记录。

1.2.3.3 皮损组织病理学观察 取各组小鼠背部皮肤1.0 cm×1.0 cm大小，10%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片、HE染色，显微镜下观察，记录并拍照存档。

1.2.3.4 皮肤PAR-2、TRPA1免疫组织化学检测   取各组小鼠背部皮肤，10%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4～5 μm厚度连续切片，采用SABC法进行免疫组织化学检测。

1.2.3.5 qRT-PCR法检测皮损组织PAR-2、TRPA1 mRNA表达 采用液氮研磨和Trizol方法提取皮肤组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，以总RNA为模板，按照Thermo反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，以Sybr Green作为荧光标志物进行PCR。反应条件为：预变性（95 ℃ 10 min），PCR（40个循环;95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;）;增加熔解曲线：60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。所有反应均设立3个复孔，以GAPDH为内参照，结果采用2-△△Ct值表示。具体引物序列见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，多组间两两比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计学分析，LSD检验进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠搔抓行为观察 各组小鼠在第1天时30 min搔抓次数差异无统计学意义（P>0.05）;AD模型小鼠在造模后第15、31天，其30 min搔抓次数均显著高于正常组（P<0.01）;经药物干预后，激素组与中药组小鼠的搔抓频次较AD模型组显著性降低（均P<0.01）。见图2。

2.2 小鼠皮损观察 AD模型小鼠背部见增厚性皮损、红斑、脱屑明显、棕红色色素沉着，部分皮损处可见结痂。麻黄连翘赤小豆汤和激素治疗后，红斑、渗出基本减轻或消失，痂皮大多脱落。见图3。

2.3 对小鼠皮肤损伤的病理学影响 正常组棘层细胞层较薄（1～2层）。AD模型组棘层细胞层明显增厚，角化珠增多，毛囊结构明显增多，角化层明显增厚，见炎性细胞浸润，表皮不平整;中药组角化层及棘层细胞层增厚，角化珠及毛囊结构略有增多，较模型组改善明显。见图4。

2.4 对小鼠PAR-2、TRPA1的蛋白表达的影响   PRR-2、TRPA1的免疫反应阳性呈现为棕黄色或棕褐色颗粒。与正常组比较，模型组皮肤组织PAR-2、TRPA1免疫反应阳性均明显增多，角质形成细胞处最为显著;激素组、中药组表达较模型组均有所降低。见图5。

2.5 对小鼠PAR-2、TRPA1的基因表达的影响   模型组小鼠皮肤组织中PAR-2的mRNA的表达较正常小鼠显著性上调（P<0.05），经过中药干预后，其表达下调显著（P<0.01）;激素组PAR-2的表达较模型组显著下调（P<0.05），与中药组差异无统计学意义（P>0.05）。如图6（B）所示，模型组小鼠皮肤组织中的TRPA1的基因表达较正常小鼠显著性上调（P<0.05），中药组与模型组比较，其TRPA1的表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）。激素组的TRPA1的表达与模型组、中药组比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。见图6。

3 讨论

AD是一种慢性皮肤瘙痒和炎症性疾病，常自婴幼儿发病，其患病率在发达国家儿童中高达15%～20%，成人为2%～10%;我国1～7岁儿童AD患病率为12.94%，成人为4.6%，并呈逐年升高趋势[13-14]。AD引发的皮肤瘙痒不可忍受并且难以治愈，还常合并哮喘、过敏性鼻炎和食物过敏，对细菌和病毒感染易感性增加，具有罹患焦虑、抑郁、注意力缺陷多动障碍等疾病倾向，严重影响患者身心健康，已成为日益严重的世界性公共健康问题[15]。尽管当前有多种针对AD瘙痒的治疗方案，如光疗、药物治疗等，但部分患者仍存在广泛的皮肤损伤与强烈瘙痒，缺乏针对疾病关键机制的有效治疗手段是其主要原因。

瘙痒的发病原因和病理机制十分复杂。目前比较公认的引发痒觉的特异性神经通路至少包括组胺依赖性神经（机械不敏感C纤维）通路和非组胺依赖性神经（机械热敏感C纤维）通路。Schmelz等[16]证实C-神经纤维中存在的对压力刺激不敏感，而对组胺等化学物质刺激持续敏感的亚单位是瘙痒信号的特定传导通路，组胺选择性作用于组胺受体可引发皮肤瘙痒。Johanek等[17]发现发痒藜豆诱导的瘙痒可通过辣椒素敏感传入神经纤维传导引发，而抗组胺剂对其瘙痒无拮抗作用，证实了非组胺依赖性效应途径的存在。进一步研究发现，非组胺依赖性瘙痒神经信号传导与TRPA1通道偶联通路密切相关，PAR-2作为这一信号通路的关键分子，可激活磷脂酶C，敏化瞬间电压感受体TRPA1通道，导致背角神经节神经细胞膜去极化，通过脊髓丘脑束传导痒觉信号至中枢的躯体感觉皮层[18]。致敏化的TRPA1可使得机体对生理性或亚生理性的内外环境的改变激活而产生伤害性感觉，这恰好与临床上慢性瘙痒的核心症状——痒觉过敏、自发性瘙痒（温热痒）等密切相关。因此，探索针对PAR-2与TRPA1的调控的药物研究可能是治疗AD的重要途径。

众所周知，中医讲求“辨证论治”，“辨证”在前，“论治”在后。AD属中医“乳癣”“奶癣”“胎敛疮”等病证范畴，历代医家对其病因病机有着丰富的论述，多认为本病因先天禀赋不足，胎毒遗热或后天调摄不当，脾失健运，生湿化热，复感风湿热邪，蕴结肌肤，内外合邪而发病[19]。麻黄连翘赤小豆汤见于《伤寒论·辨阳明病脉证并治篇》，具有解表散热，清热利湿解毒之功，主治伤寒瘀热在里发黄之证。方中连翘，宋本《伤寒论》原文注云“连翘根是”，现今临床多代以连翘，因而也被称为麻黄连翘赤小豆汤。现今临床广泛应用本方治疗水肿、AD、湿疹及过敏性疾病，证属湿热熏蒸于表者。如周芳等[20]用麻黃连翘赤小豆汤加减（名为“抗敏一号”）治疗青少年及成人AD，可明显改善AD皮损及瘙痒，疗效优于开瑞坦;本课题组也常用本方治疗AD、湿疹等皮肤病，屡获良效。

有关麻黄连翘赤小豆汤治疗AD的效应机制，目前尚未见报道，仅有抗变态反应等相关研究，如邱明义等[21]、陈建等[22]发现本方可抵抗组胺引起的瘙痒、抑制IgE产生和肥大细胞脱颗粒。本实验结果表明，麻黄连翘赤小豆汤可降低AD模型小鼠搔抓行为、有效改善模型小鼠皮损改变，进一步确证了本方治疗AD及其引发的皮肤瘙痒的有效性。本实验结果还证实，麻黄连翘赤小豆汤可下调AD皮损组织中PAR-2与TRPA1的基因与蛋白表达，提示该方改善皮损减轻瘙痒可能与影响上述环节，进而调控非组胺依赖性神经信号传导有关，为阐明麻黄连翘赤小豆汤防治AD的现代生物学机制与调控靶点奠定了基础。

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（2020-06-28收稿 责任编辑：王明）