西南委陵菜质量标志物初步研究及指纹图谱结合多元统计综合评价其质量

李学学，曹亚楠，苏宏娜，黄艳菲，李 莹，杨正明，蔡晓霞，沈继秀，刘 圆,7*

1.西南民族大学药学院，四川 成都 610225

2.成都大学食品与生物工程学院，四川 成都 610106

3.农业农村部杂粮加工重点实验室，四川 成都 610106

4.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610225

5.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225

6.青藏高原民族药用资源保护与利用国家民委重点实验室，四川 成都 610225

7.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041

西南委陵菜PotentillafulgensWall.ex Hook.为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物，以其干燥根入药，是彝医临床常用药材，别名管仲、翻白叶、地槟榔等[1-2]。西南委陵菜始载于《滇南本草》[3]，味苦、涩，性寒；主治血崩、大肠下血、面寒疼。彝医临床将其用于治疗胃肠道疾病、痢疾、疮、风湿等[4-5]。现代药理研究发现西南委陵菜具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、降血糖等药理活性[6-9]。虽然西南委陵菜在彝医临床应用广泛，但云南省中药材标准[2]仅对鉴别、检查、浸出物做了要求，未有科学可靠的质量标志物进行质量控制，而质量标志物是目前评价药材质量的基本方法[10]，现有化学成分的研究结果尚不确定西南委陵菜所分离鉴定的成分是否为其提取物的主要成分并保证含量可测性[11-12]，因此，有必要筛选西南委陵菜的质量标志物，为西南委陵菜药材质量评价和质量控制提供科学依据。

本研究通过UPLC-Q-Exactive-MS/MS 法定性分析西南委陵菜的化学成分组成，筛选质量标志物；采用HPLC 法建立不同批次西南委陵菜的指纹图谱，定量分析质量标志物的含量；进而通过主成分分析（PCA）和TOPSIS 分析综合评价西南委陵菜药材质量，为西南委陵菜质量标准提高、质量评价系统研究提供科学依据，同时为其他民族药材的质量评价研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器与试剂

ThermoFisher Scientific Vanquish 超高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；ThermoFisher Scientific Q Exactive Focus 超高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；安捷伦1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；KQ-259DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER AE240 电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

表儿茶素（批号MUST-20042012）、没食子酸（批号 MUST-20032802）、紫云英苷（批号MUST-15080515）购自成都曼斯特生物技术有限公司；儿茶素（批号15080412）购自成都康邦生物科技有限公司，质量分数均大于98%；乙腈、甲醇、甲酸、磷酸（色谱纯，DiKMA）；甲醇（分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司）；蒸馏水（屈臣氏）。

1.2 材料

西南委陵菜药材均由课题组和四川省彝医药非物质文化继承人郝应芬（阿子阿越）带队自采于四川省凉山州和攀枝花米易县等地，经西南民族大学刘圆教授鉴定为西南委陵菜P.fulgensWall.ex Hook.，标本保存于西南民族大学民族药材标本馆，样品信息见表1。

表1 西南委陵菜药材采集信息Table 1 Collection information of P.fulgens

2 方法

2.1 UPLC-Q-Exactive-MS/MS 分析

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters 公司），进样量2 μL，柱温35 ℃，体积流量0.2 mL/min。检测波长210～400 nm。流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～3 min，6%A；3～10 min，6%～9%A；10～25 min，9%～10%A；25～34 min，10%～13%A；34～37 min，13%A；37～45 min，13%～15%A；45～50 min，15%～18%A；50～55 min，18%～20%A；55～60 min，20%～40%A。

2.1.2 质谱条件 离子源为ESI 源，负离子检测模式：辅助气体积流量 10 mL/min；辅助气温度350 ℃；离子传输管温度320 ℃；锥孔气流量40 L/h；喷雾电压3.5 kV；扫描模式：Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，扫描范围m/z100～1000。

2.1.3 对照品溶液的制备 分别精密称量表儿茶素、儿茶素、没食子酸、紫云英苷于25 mL 量瓶中，用50%甲醇溶解稀释至刻度，得表儿茶素质量浓度为0.40 mg/mL，儿茶素质量浓度为0.40 mg/mL，没食子酸质量浓度0.40 mg/mL，紫云英苷质量浓度0.40 mg/mL，即为混合对照品溶液。

2.1.4 供试品溶液的制备 取S10 样品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，称定质量，加热回流90 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得分析样品。

2.2 HPLC 指纹图谱及含量测定

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0～15 min，2%～10% A；15～25 min，10%～15% A；25～45 min，15%～20%A；45～65 min，20%～22% A；检测波长为270 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温为35 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 取表儿茶素对照品适量，精密称定，置于10 mL 量瓶内，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，得1.022 mg/mL 对照品储备。精密量取上述储备液适量，用50%甲醇依次稀释，得表儿茶素质量浓度分别为0.204 4、0.153 3、0.102 2、0.051 1、0.020 4 mg/mL 系列混合对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 所有待测样品按“2.1.4”项下方法进行制备。

2.2.4 线性关系考察 准确吸取一定量的对照品溶液，用50%甲醇稀释至不同质量浓度的系列对照品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件进行测定。以对照品的质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性分析，得回归方程Y＝4 962.2X＋4.036 6，线性范围0.204 4～2.044 0 mg/mL，r＝0.999 8。

2.2.5 精密度试验 取适量“2.2.2”项配制的对照品溶液，按照“2.2.1”项色谱方法连续进样6 次，测定峰面积。结果显示表儿茶素峰面积的RSD 值为0.45%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批样品（S5）6 份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，测得供试品溶液表儿茶素平均质量浓度分别为10.43 mg/g，RSD 为1.48 %，表明实验重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 选取“2.2.2”项下配好的对照品溶液，按“2.2.1”项下方法，在放置0、6、12、18、24 h 后进样测定，根据表儿茶素峰面积计算其RSD 值。其RSD 结果为0.78%，说明供试品溶液在制备后24 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取同一批样品（S5）按照“2.1.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按照供试品浓度-对照品大致1∶1 的比例分别加入表儿茶素。表儿茶素的加样回收率为93.51%，RSD 值为1.36%。

2.3 数据分析

利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版”对27 批西南委陵菜样品进行相似度分析，并生成西南委陵菜指纹图谱。利用SPSS20.0软件对西南委陵菜进行TOPSIS 分析；以表儿茶素含量和采集地海拔为变量，对两者进行相关性分析。

3 结果与分析

3.1 UPLC-Q-Exactive-MS/MS 定性分析

对S10 号样品进行UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析，负离子模式基峰色谱图见图1。通过与对照品比对、对照品质谱裂解规律结合SciFinder 等数据库、文献数据比对的方式，从样品中指认了48 个化合物，包括原花青素类34 个、黄酮类12 个、酚类1 个、鞣质类1 个，结果见表2。

图1 样品(S10)负离子模式基峰色谱图Fig.1 Negative ion mode base peak chromatogram of sample(S10)

表2 西南委陵菜UPLC-Q-Exactive-MS/MS 化学成分鉴定结果Table 2 Results of UPLC-Q-Exactive-MS/MS identification of chemical constituents from P.fulgens

通过提取离子的方式与对照品比对确认的4 个成分，保留时间2.96、13.93、22.83、54.83 min 依次为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、紫云英苷。

续表2

以儿茶素、表儿茶素、阿福豆素聚合形成的原花青素为西南委陵菜样品中的主要成分，以保留时间为12.61 min 的procyanidin B 为例说明解析过程。可见其准分子离子m/z577.135 0[M-H]-，预测分子式C30H26O12，不饱和度18。二级质谱中，与对照品儿茶素的质谱裂解规律对比可知，m/z289.071 5为儿茶素特征峰，结合儿茶素对照品的特征碎片离子m/z245.081 2、231.028 3、203.070 1、187.039 5、179.034 0、151.038 9、137.023 1、125.023 1、109.028 2，故推测该化合物结构母核为儿茶素。二级质谱中，m/z577.135 0 与m/z289.071 5 相差288.063 5（C15H14O6），元素组成与脱氢儿茶素一致，结合文献数据[18-19]，故推测该化合物可能是procyanidin B。黄酮类成分为西南委陵菜样品中的另一类主要成分，除了通过对照品比对的3 个黄酮类成分，还指认了9个黄酮类成分，以保留时间23.46 min 的化合物为例，说明黄酮类成分的解析过程。负离子模式一级质谱显示准分子离子m/z449.108 6[M-H]-，预测分子式为C21H22O11，不饱和度为11。二级质谱中，m/z287.055 6（C15H11O6）与m/z449.108 6 相差162.053 0（C6H10O5），推测由准分子离子丢失葡萄糖基产生；m/z287.055 6 丢失1 分子水，产生m/z269.045 2[M-H-glu-H2O]，说明化合物含有羟基；m/z287.055 6丢失羰基产生m/z259.060 7[M-H-glu-CO]，说明化合物含有羰基；m/z287.055 6 脱去CO2产生m/z243.067 0[M-H-glu-CO2]；特征离子m/z178.997 9（1-2A-）和中性丢失108.057 7（1-2B）表明，该化合物为黄酮，且B环上有1个羟基；m/z107.012 1（0,4A-）表明A 环有2 个羟基。综上推测，该化合物为二氢山柰酚葡萄糖苷。液质分析研究结果表明，样品基峰色谱图中峰高较高的峰为表儿茶素、儿茶素聚合物、儿茶素和阿福豆素的聚合物，然而除了表儿茶素，其他成分也均与儿茶素或表儿茶素相关，从质量标志物的可测性来考虑，表儿茶素含量较高、在HPLC 中分离度好、色谱图中峰纯度高，故西南委陵菜的质量评价研究可初步筛选表儿茶素作为质量标志物，结合指纹图谱和多元统计分析，可科学评价西南委陵菜药材质量。

3.2 HPLC 指纹图谱研究及含量测定

3.2.1 指纹图谱建立与相似度分析 按“2.1.4”项下方法分别制备27 批西南委陵菜供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，分别记录其HPLC 色谱图。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 版）对西南委陵菜样品指纹图谱进行全谱峰匹配，设定时间宽度为0.2，以S15药材HPLC 图谱作为参照图谱进行匹配，按照中位数法生成西南委陵菜对照指纹图谱（图2）。经色谱峰匹配，西南委陵菜对照指纹图谱有10 个共有峰，共有峰的峰面积均占总峰面积95%以上，符合特征图谱的技术要求，指认出6 号峰为表儿茶素。对27批西南委陵菜药材指纹图谱进行相似度评价，结果西南委陵菜相似度在0.960～0.998，见表3。表明不同产地西南委陵菜指纹图谱相似度较高，药材质量较均一和稳定。

图2 西南委陵菜对照图谱(A)与样品指纹图谱(B)Fig.2 Fingerprint map of control(A)and samples of P.fulgens(B)

表3 西南委陵菜指纹图谱相似度Table 3 Fingerprint similarity table

3.2.2 含量测定结果 按照“2.2.1”项下条件测定西南委陵菜样品，每个样品平行测定3 次，从结果可以看出，不同产地和不同批次之间含量有差异。对27 批西南委陵菜药材中的表儿茶素含量和采集地海拔进行相关性分析，表儿茶素含量测定结果见表4，由此发现表儿茶素含量和海拔呈正相关（相关系数0.705，P＜0.01），表儿茶素含量随海拔高度变化见分析热图（图3），热图结果进一步表明，随海拔的升高，西南委陵菜药材中表儿茶素含量升高，说明表儿茶素含量受海拔高度影响。

表4 表儿茶素测定结果Table 4 Results of epicatechin determination

表4 表儿茶素测定结果Table 4 Results of epicatechin determination

编号 质量分数(mg·g-1)编号 质量分数/(mg·g-1)S1 8.76±0.08 S15 6.47±0.03 S2 9.66±0.04 S16 16.50±0.03 S3 10.77±0.24 S17 9.88±0.10 S4 10.58±0.31 S18 8.76±0.79 S5 10.55±0.13 S19 8.32±0.33 S6 9.95±0.07 S20 6.78±0.02 S7 9.43±0.04 S21 6.01±0.05 S8 11.48±0.05 S22 14.42±0.08 S9 11.53±0.06 S23 9.11±0.22 S10 10.51±0.49 S24 20.22±1.59 S11 11.48±0.07 S25 6.75±0.07 S12 10.27±0.14 S26 16.55±0.08 S13 10.76±0.13 S27 8.28±0.11 S14 12.13±0.23

图3 表儿茶素含量随海拔高度变化分析热图Fig.3 Heat map analysis of epicatechin content with altitude

3.2.3 主成分分析 由于指纹的变量较多，PCA 被用于数据压缩和样本分类的信息提取。为了全面评价基于指纹图谱数据的27 批西南委陵菜样本的相似性和差异性，用检测到的10 个共有峰的峰面积为原始数据，利用SPSS 20.0 统计软件进行主成分分析，计算相关矩阵的特征值及其方差贡献率（表5），以特征值＞1 为提取标准，得到前3 个主成分的累计方差贡献率为89.691%（＞80%），说明前3 个主成分反映了西南委陵菜中所有峰的情况，基本上可以表征西南委陵菜的HPLC 指纹图谱特征。同时，本研究对各主成分的权重比例与各共有峰对应的相关系数（表6）进行分析。结果表明，指认出的表儿茶素和其他未知成分均作为主要信息参与了西南委陵菜的质量表达，其中第1 主成分主要反映了色谱峰3、6（表儿茶素）、7、8、9、10 的信息表达，第2 主成分主要反映了色谱峰1、4 的信息表达，第3 主成分主要反映了色谱峰5 的信息表达。

表5 西南委陵菜指纹图谱主成分信息和方差贡献率Table 5 Principal component information and variance contribution rate of fingerprint of P.fulgens

表6 主要因子载荷矩阵表Table 6 Main factor load matrix table

3.2.4 TOPSIS 分析 将检测到的10 个共有峰的峰面积为原始数据，利用SPSS 20.0 统计软件进行Zscore 标准化处理后进行TOPSIS 分析，以分析和比较不同产地西南委陵菜的质量差异，结果如表7所示。由表7 可知，S11 的质量最佳，S9 的质量最次，指纹图谱共有峰数据可作为西南委陵菜药材质量评价的依据，TOPSIS 分析可用于西南委陵菜的质量评价。

表7 TOPSIS 评价结果Table 7 TOPSIS evaluation results

4 讨论

本研究通过UPLC-Q-Exactive-MS/MS 研究，详细分析了西南委陵菜药材中的化学成分，共指认48个化学成分，发现原花青素类成分和黄酮类成分为西南委陵菜的主要成分，此外还有含有酚类和鞣质类成分，研究结果较Choudhary 等[20]通过NMR 和LC-MS/MS 发现鉴定的西南委陵菜25 个化学成分有了更多发现。通过液质分析初步筛选了含量高、可测性好、原花青素类成分基本组成单元的表儿茶素作为质量标志物，对西南委陵菜药材进行质量评价研究。现代药理研究表明，表儿茶素具有抗炎、抗菌、抗氧化、调脂降糖、防治心血管疾病、提高免疫力等广泛的生理活性[21]，与西南委陵菜药理活性具有相关性，因此，选择表儿茶素作为西南委陵菜的质量标志物具有一定科学意义。

通过指纹图谱的定性定量分析，结合多元统计分析综合评价彝药材西南委陵菜的质量评价研究方法，初步阐明了西南委陵菜药材的化学成分，筛选了与生理活性具有一定相关性、可测性好的成分作为质量标志物，综合评价西南委陵菜药材，研究结果为西南委陵菜质量标准完善、科学合理用药提供科学依据，同时为其他研究基础薄弱的民族药材质量评价研究提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突