葛根中黄嘌呤氧化酶抑制剂对GES-1细胞诱导的氧化应激保护作用

2021-06-24方一帆刘心越汤小胜

湖北理工学院学报 2021年3期

冯航，方一帆，刘心越，汤小胜

(湖北师范大学 a.食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室,b.生物学国家级实验教学示范中心,c.生命科学学院，湖北黄石435002)

黄嘌呤氧化酶(XO)是一种重要的胞浆酶，可以催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，并进一步催化黄嘌呤氧化为尿酸。XO功能异常会导致高尿酸血症、痛风等多种疾病[1]。别嘌呤醇、别嘌硫醇和3,5-二取代-1,2,4-三唑是传统的XO抑制剂[2]。这些抑制剂因具有进行性肾功能衰竭、皮肤问题、史蒂文斯-约翰逊综合征和重型肝炎等许多不良副作用而被限制使用[3-4]。因此，需要从天然产物提取物中制备出副作用小、疗效好的XO抑制剂[5-6]。

天然产物提取物中含有生物活性化合物，其中，异黄酮类化合物是葛根提取液中的主要活性成分，对抗氧化性、高血压和糖尿病具有诸多益处[7-8]。然而，由于天然产物提取物的成分复杂、活性成分分离困难且费时，使其在相关领域的应用受到限制[9]。超滤与液相色谱-质谱联用(UF-LC-MS)是从天然化合物等复杂混合物中筛选生物活性化合物的一种有效和广泛应用的技术[10]。

本文借助UF-LC-MS法从葛根提取液中筛选XO抑制剂，对4种与XO有结合活性的化合物进行鉴定，并通过测定IC50验证其抑制性。通过评价细胞活性、细胞内ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)释放和细胞凋亡等指标，研究4种抑制剂对过氧化氢(H2O2)诱导的人正常胃上皮细胞(GES-1细胞)氧化应激模型的保护作用，旨在为葛根提取液对XO抑制作用和氧化应激保护方面的应用提供实验依据。

1 实验

1.1 实验材料及药品

XO购自源叶生物科技有限公司(上海)；葛根购自老百姓药房(长沙)；乙睛购自德国Merck公司(色谱纯)；超纯水由ELGA净水系统制备(电阻率为18.2 MΩ·cm)；其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司(上海)。

1.2 葛根提取液的制备

将葛根粉碎，并在4 ℃下贮藏，采用微波辅助萃取法提取葛根。称取30.0 g葛根粉末转移到装有200 mL 90%乙醇溶液(V∶V)的烧杯中，微波炉中以60%的功率提取该溶液3次，每次提取6 min。将3次的提取液合并，并在真空下用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂。将2.08 g残留物溶解在水中，并在4 ℃下储存。

1.3 抑制实验

首先，将20 μL 1 mg/mL的XO溶液和样品混合在石英比色皿中。然后，添加1 mL 1 mg/mL的嘌呤溶液开始酶反应。将比色皿快速移入紫外可见分光光度计(型号为UV2700，日本)中，在295 nm处测定其吸光度值。相同条件下，用等量的水代替样品作为空白对照。样品的抑制作用是以抑制了50% 酶活性所需的样品浓度(IC50)来表示，所有实验均重复3次。XO抑制率计算公式为：

抑制率=(1-ΔAs/ΔAb)×100%

(1)

式(1)中，ΔAs和ΔAb分别为样品和空白吸光度的增加值。

1.4 XO抑制剂的筛选

将250 μL 0.75 mg/mL 的XO溶液与250 μL 100 mg/mL的葛根提取液在试管中混合，25 ℃下用恒温振荡器孵育30 min。孵育后，将混合物转移到超滤过滤器(型号为YM-30，截止分子量为10 kDa)中， 4 ℃下13 000 r/min离心20 min。为了去除非特异性结合，向过滤器中加入500 μL水，相同条件下继续离心。此外，向过滤器中添加250 μL 80%甲醇溶液，洗脱与XO结合的抑制剂， 4 ℃下13 000 r/min离心20 min。收集滤液，用HPLC和LC-MS对滤液进行分析。以高温处理后的变性酶为替代物，相同条件下进行对照实验。

1.5 所筛选化合物的HPLC分析与鉴定

采用C18反相色谱柱250×4.6 mm i.d. ，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，在高效液相色谱系统(Agilent 1260，购自美国)上完成样品的定性分析和结合度的计算。以0.1%醋酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱(0～10 min乙腈浓度为10%和10～40 min乙腈浓度为10%～55%)。使用0.45 μm膜过滤后注入5.0 μL样品，在波长为254 nm处记录色谱图。在LC-MS系统(Agilent 6460，购自美国)上完成筛选出的化合物的化学结构鉴定。

HPLC分析与鉴定的条件与上述条件相同。采用电喷雾离子源(ESI)的正负离子模式。质量检测模式设置为100～1 000 M/z全扫描模式。

1.6 所筛选化合物对GES-1细胞氧化应激的影响

1.6.1细胞培养

人正常胃上皮细胞(GES-1细胞)购自玉溪生物技术有限公司，将GES-1细胞放在含有10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle培养基(澳大利亚吉布科市)中培养。37 ℃下，在带有5% CO2的孵化器中进行孵育。

1.6.2细胞毒性测试

采用细胞计数试剂盒(CCK-8)评估4种筛选化合物存在下H2O2对GES-1诱导的细胞毒性。将GES-1细胞悬浮液(每个孔2×105～3×105细胞)接种到96孔板中并预孵育过夜。将GES-1细胞在4种筛选化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4种筛选化合物浓度分别为10，25，50，100 μmol/ L。暴露后，每孔加入10 μL CCK-8反应液，在培养箱中培养2 h。用酶标仪(购自美国)测量每个孔在波长450 nm处的吸光度。以没有暴露在H2O2中的GES-1细胞作为空白对照。

1.6.3细胞内ROS和SOD的测定

根据文献[11]，用二氢乙啶探针(DHE，购自中国南通碧云天生物技术研究所)测定细胞内的过氧化合物ROS。将GES-1细胞在4种筛选化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4种筛选化合物浓度分别为10，25，50，100 μmol/ L。暴露后，在含有5 μmol/L DHE的培养基中孵化30 min，测定红色ROS产物的量。然后，在激发波长为530 nm下，用酶标仪读取细胞在600 nm处的荧光光谱。

SOD活性采用总超氧化物歧化酶试剂盒(WST-8，购自中国碧云天生物技术研究所)来测定[12]。将20 μL样品溶液、160 μL WST-8/酶测试液(含1 μL酶溶液、151 μL SOD检测缓冲液、8 μL WST-8)与20 μL反应引发液(由1 μL反应工作储备液加入39 μL SOD缓冲液稀释而成)混合。37 ℃下孵育30 min后，使用酶标仪记录波长450 nm处样品的吸光度值。所有实验均平行测定3次。

1.6.4 LDH释放测定

细胞膜受损时，细胞质会释放LDH，采用LDH细胞毒性检测试剂盒(购自中国碧云天生物技术研究所)对LDH完成定量分析，评价细胞膜的完整性[13]。将GES-1细胞在4种筛选化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4种筛选化合物浓度分别为10，25，50，100 μmol/ L。暴露后，将细胞板离心5 min，轻轻抽吸培养基。然后，向细胞中加入150 μL乳酸脱氢酶释放试剂，孵育1 h。最后，移出离心5 min后的细胞培养基上清液用于LDH测定。在各细胞培养基上清液中加入60 μL检测液，细胞板避光孵育30 min，采用光化学法，在波长490 nm处测吸光度值。对照组LDH活性按LDH活性百分比计算。

1.6.5 GES-1细胞凋亡测定

将GES-1细胞在4种筛选化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4种筛选化合物浓度分别为10，25，50，100 μmol/ L。孵育结束后，收集细胞并用冷的PBS洗涤2次。将细胞重新悬浮在300 μL的结合缓冲液中，用5 μL膜联蛋白异硫氰酸V-荧光素(V-FITC)和10 μL碘化丙锭(PI)避光染色15 min，用流式细胞仪检测并分析凋亡率。

2 结果与讨论

2.1 葛根提取液中XO抑制剂的筛选

2.1.1高效液相色谱条件的优化

XO抑制剂筛选前首先测试葛根提取液对XO的抑制作用，其水提取液的IC50值为96.0 μg/ mL，表明葛根提取液中含有XO抑制剂。通过超滤和水洗后，用HPLC分析含XO抑制剂的甲醇洗脱液。同时以变性酶在相同条件下进行对照实验。

超滤后的葛根提取液和洗脱液的色谱图如图1所示。从图1可以看出，葛根提取液的色谱图(a)中主峰分离，可以清晰地观察到葛根提取液中几种XO抑制剂的峰形和峰宽。在洗脱液的色谱图(b)中可以清晰地找到4个峰，在相同保留时间下，这4个峰也出现在葛根提取液的色谱图中。同时对照组洗脱液的色谱图显示，在40 min内没有出现峰，证实了图1中4个标有数字的峰与XO特异结合。因此，有必要对这4个峰进行进一步的鉴定和分析。

图1 超滤后的葛根提取液和洗脱液的色谱图

2.1.2筛选出的XO抑制剂的鉴定

通过与标准品的保留时间、紫外数据和质谱数据进行分析和比较，采用HPLC-MS进行鉴定，确定了4种抑制剂的结构，分别为葛根素(Puerarin)、黄豆苷(Daidzin)、黄豆苷元(Daidzein)和染料木黄酮(Genistein)[14-15]。4种筛选抑制剂的识别信息见表1。4种抑制剂标准品及葛根提取液的色谱图如图2所示。从图2可以看出，葛根提取液中4种XO抑制剂的保留时间与标准品的保留时间是相同的，表明这4个峰的鉴别是可信的。

表1 4种筛选抑制剂的识别信息

图2 4种抑制剂标准品及葛根提取液的色谱图

由表1可以看出，这4种筛选抑制剂在波长255 nm处有最大吸收，在波长320 nm处有二次吸收，这是异黄酮衍生物典型的吸收光谱。在正模式和负模式下，化合物1和2的去质子化分子离子峰[M+H]+和[M -H]-分别为417和415 M/z，化合物3的去质子化分子离子峰[M + H]+和[M -H]-分别为255和253 M/z，化合物4的去质子化分子离子峰[M + H]+和[M -H]-分别为271和269 M/z。此外，化合物2还有一个分子离子峰[M+CH3COOH-H]-为475 M/z，对于化合物3的分子离子峰[2M -H]-为507 M/z。

2.1.3筛选出的XO抑制剂的抑制作用

从葛根提取液中筛选、鉴定出4种XO抑制剂后，对4种XO抑制剂的抑制作用进行测试，葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮的IC50值分别为30.8，5.31，14.5，3.02 μg/mL。结果表明，这4种化合物对XO有抑制作用。同时，其他研究者也报道了这4种化合物对XO的抑制作用[2,16-17]，表明所筛选的化合物确实对XO有抑制作用。

2.2 筛选出的抑制剂对GES-1细胞氧化应激的影响

2.2.1 GES-1的细胞毒性

为了评价4种抑制剂对H2O2诱导的细胞毒性的保护作用，以GES-1细胞为研究对象进行CCK-8实验。4种抑制剂对GES-1细胞活力的影响如图3所示。从图3(a)可以看出，在浓度为250 μmol/L H2O2存在的72 h内，GES-1细胞活力降低至75.0% 。然而，当有葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮这4种抑制剂(浓度范围分别为10，25，50，100 μmol/L)存在时，细胞活力显著提高，且随着浓度的增加，保护效果增强。每一种抑制剂都存在一个最佳浓度，在此浓度下，保护效果最佳。为了排除4种化合物的细胞毒性，对正常GES-1细胞进行了对照实验。从图3(b)可以看出，在相同浓度下，4种抑制剂的存在会引起细胞活力小幅下降。结果表明葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮均能改善H2O2诱导的GES-1细胞氧化损伤，且不会带来额外的细胞毒性。

(a) H2O2诱导GES-1细胞

(b) 正常GES-1细胞

2.2.2细胞内ROS水平

4种抑制剂对H2O2诱导的细胞内ROS水平的影响如图4所示。由图4可以看出， H2O2处理后细胞内ROS水平明显高于对照组。葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮的加入均能显著降低ROS水平，呈剂量相关性。在浓度为100 μmol/L的葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮存在下孵育72 h后，ROS的相对生成量最低，ROS水平几乎降至正常水平。

图4 4种抑制剂对H2O2诱导的细胞内ROS水平的影响

2.2.3细胞内SOD水平

SOD的表达和活性在清除细胞内的自由基以调节ROS水平方面起着重要作用[18]。4种抑制剂对H2O2诱导的细胞内SOD水平的影响如图5所示。从图5可以看出，与对照组相比，过氧化氢显著阻碍了SOD的活性。但是，葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮对氧化应激下SOD活性降低具有恢复作用，呈剂量相关性。结果表明葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮是通过清除H2O2诱导的ROS积累和激活抗氧化酶，从而保护GES-1细胞的抗氧化性。

图5 4种抑制剂对H2O2诱导的细胞内SOD水平的影响

2.2.4细胞内LDH释放

胞浆释放的LDH浓度能反映细胞膜的完整性。4种抑制剂对H2O2诱导的细胞LDH释放的影响如图6所示。从图6可以看出，GES-1细胞暴露于250 μmol/L H2O272 h后，培养基中的LDH浓度几乎是对照组的2.5倍。葛根素、黄豆苷、黄豆苷元、染料木黄酮与H2O2共孵育细胞后，LDH释放量显著降低，且呈剂量相关性。当4种抑制剂的浓度达到100 μmol/L时，与对照组相比，未检测到LDH释放水平的差异。结果表明葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮对H2O2诱导的GES-1细胞膜损伤有明显的保护作用。

图6 4种抑制剂对H2O2诱导的细胞LDH释放的影响

2.2.5细胞凋亡测定

为了进一步研究4种抑制剂对细胞凋亡的影响，用流式细胞仪测定了GES-1的细胞凋亡率。不同浓度下4种抑制剂对GES-1细胞凋亡速率的影响见表2；4种抑制剂对GES-1细胞凋亡的影响如图7所示。

(a) 对照细胞 (b) 250 μmol/L H2O2 (c) 100 μmol/L葛根素和H2O2

(d) 100 μmol/L黄豆苷和H2O2 (e) 100 μmol/L黄豆苷元和H2O2 (f) 100 μmol/L染料木黄酮和H2O2

表2 不同浓度下4种抑制剂对GES-1细胞凋亡速率的影响

从表2和图7可以看出，在暴露于250 μmol/L H2O272 h后，早期和晚期凋亡细胞的百分率较高，分别从0.1%增加到11.4%和63.3%。葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮对H2O2诱导的细胞凋亡呈剂量相关。随着4种抑制剂浓度增加，早期和晚期凋亡细胞的百分率呈下降趋势。在H2O2存在时，采用浓度为100 μmol/L葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮处理后，早期和总凋亡细胞的百分率显著下降。因此，在葛根素、黄豆苷、黄豆苷元和染料木黄酮的存在下，GES-1细胞能够抵抗H2O2诱导的氧化应激。